【正文】 ranslation OH p OH+ P P DNA dNTP ， DNA酶 I，DNA聚合酶 I 32PdNTP BiodNTP 隨機引物標記探針 5` 3` 5` 5` 3` DNA 32pdNTP,BioDntp 6bp primer Klenow,dNTP 變性 復(fù)姓 末端標記法 ? T4多核苷酸激酶法 ? 靜夜四無鄰，荒居舊業(yè)貧。 其主要用途有： A、在 cDNA合成過程中，切開 cDNA的發(fā)夾末端； B、載體構(gòu)建過程中，切去 DNA片段的單鏈尾巴， 形成平末端結(jié)構(gòu)。 特別是， T4DNA聚合酶還有第三種活力 — 取代反應(yīng)： 如果反應(yīng)體系中僅存在一種 dNTP，這時 T4DNA聚合酶就會表現(xiàn)出3 ′→ 5 ′ 外切酶活力，從雙鏈 DNA的 3′ 開始降解，直到露出和缺乏的那中 dNTP互補的堿基，然后就在此位置發(fā)生合成和取代反應(yīng)。不過對于雙鏈的降解可被 5′3′的多聚活性所抑制。 它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。 OH P 是相鄰的－ 因此不能封閉 gap，只能封閉 nick. gap NO Nick OK DNA 連接酶連接的作用機制 ⑴ E(酶 )＋ ATP→E － AMP＋ ppi E(酶 )＋ NAD→E － AMP＋ NMN ⑵ E－ AMP ＋ DNA＝ DNA－ AMP＋E ⑶ DNA上的 3’ － OH對被活化的磷原子進行親核攻擊 ， 形成磷酸二酯鍵 ， 同時釋放出 AMP。請根據(jù)這些結(jié)果繪制一個限制性圖譜，要標明 EcoR Ⅰ 和 Hpa Ⅱ 識別位點間的相對位置，以及它們之間的距離（ kb）。 酶單位的定義和影響酶活性的因素 Buffer (10X) ?L Water ?L DNA ?L Enzyme ?L Volume ?L 酶切反應(yīng)的基本步驟 ＋ － 電泳 紫外分析 37℃ 1h 加反應(yīng)液 CK M CK M T T 酶量的確定： 23 倍才能保證完全消化； DNA識別位點的密度 有關(guān) 酶切操作注意事項 ? 選擇正確的酶 ? DNA的純度和濃度 ? 反應(yīng)體系甘油的量 5%（ 酶保存在 50％ 甘油中 ， 故所加酶液體積最多為酶切反應(yīng)總體積的 1/10） 。 切割位點的規(guī)范性 : 雙鏈 DNA被酶切后，分布在兩條鏈上的 切割位點旋轉(zhuǎn)對稱 （可形成粘性末端或平末端的 DNA分子）。 工具酶是對野生菌株（或真核生物如酵母）進行改造、優(yōu)化、而產(chǎn)生的生物工程產(chǎn)品。 限制性核酸內(nèi)切酶 ① 50年代后 Luria和 Human(1952) Bertani和Weigle(1953)發(fā)現(xiàn) 細菌的?限制?現(xiàn)象 ： Phageλ（ k） 感染 k 不感染 E .coli B (E .coli B 限制 λ（ k） ) ② 仍有少量 λ(K)可在 B中生存，是因 B對 λ(K)DNA B 修飾 λ (k)* 感染 (B) λ 細菌如何對 λ 噬菌體進行限制和修飾 ? 細菌的限制 修飾系統(tǒng) ?細菌的限制 — ① 1962年 (瑞士 )發(fā)現(xiàn)，寄主對噬菌體的修飾是 在 Phageλ的 DNA上。 識別序列中的堿基被甲基化修飾后會影響部分酶的切割作用效果。 ? 酶保存在 200C；使用時在 冰浴 上操作 。 EcoR Ⅰ Hpa Ⅱ EcoR Ⅰ +Hpa Ⅱ DNA連接酶 環(huán)形 DNA分子的發(fā)現(xiàn)使科學(xué)家相信一定有一種能連接這種 Nick的酶存在。 DNA連接反應(yīng)的條件 4℃ 過夜 加反應(yīng)液 連接反應(yīng)最佳溫度為 37℃ ，但是此時粘性末端間氫鍵結(jié)合不夠穩(wěn)定，而且酶活性也會迅速降低。 粘性末端容易通過堿基配對形成如同銜接物一樣的二聚體分子。 大腸桿菌 DNA聚合酶 I （ E. Coli DNA pol I） 大腸桿菌三種 DNA聚合酶特性比較 大腸桿菌聚合酶 Ⅰ 的應(yīng)用示例 ? 缺口平移： 雙鏈 DNA的單鏈缺口在 DNA聚合酶 Ⅰ 的 5’ 3’外切作用下，從缺口的 5’端逐步水解核苷酸時，酶的聚合活性則利用缺口的 3’端游離羥基逐個加上相應(yīng)的單核苷酸，使得缺口向下游移動。 CGTCGC GCAGCG CGT GCAGCG dTTP Mg++ CG GCAGCG dTTP Mg++ T4DNA聚合酶的用途 （ 3’末端）或平頭末 端的雙鏈 DNA片段 DNA序列分析 T7DNA聚合酶 1000倍 逆轉(zhuǎn)錄酶 —Reverse transcriptase 逆轉(zhuǎn)錄酶是 一種可以有效地將 mRNA轉(zhuǎn)錄成為 DNA的酶，其產(chǎn)物稱為 cDNA(plementary DNA).實際上，它也是一種 RNA依賴的DNA聚合酶。 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的切除 單鏈尾巴的切除 3 ’ AAAAAAAAA A A A A A A A5 ’ T T T T T T T T TAAAAAAAAT T T T T T T T T5 ’ T T T T T T T T T3 ’ AAAAAAAATTAAAATT 末端轉(zhuǎn)移酶的特性 ?末端轉(zhuǎn)移酶是一類不依賴于 DNA模板的 DNA聚合酶 。 , January 23, 2023 ? 雨中黃葉樹，燈下白頭人。 2023年 1月 23日星期一 11時 47分 24秒 11:47:2423 January 2023 ?