【正文】 研究方法 54 總體目標(biāo)：系統(tǒng)控制與優(yōu)化 發(fā)酵 酶轉(zhuǎn)化 分離提取 一級加工 主產(chǎn)物 副產(chǎn)物 ……… . 分離濃縮 發(fā)酵 酶轉(zhuǎn)化 分離提取 產(chǎn)物 1 產(chǎn)物 2 ……… . 二級加工 有機(jī)廢物 (廢水 ) 厭氧酸化 好氧發(fā)酵 產(chǎn)物 1 產(chǎn)物 2 三級加工 原料 兩級發(fā)酵資源化過程技術(shù) 舉例 7：多級生物轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)多產(chǎn)品聯(lián)產(chǎn) 55 H O O HO HC l C lO HOC H C H2H2CC lHOO HOH O O HOH O HO HOH O O HO HOH O O HOOH O O HO HOOH O O HOOOH OO HOOH O O HP P TO HO HOOOH O H2CH O O R1O HR2O O R1O Hm o n o , d i a n d t r i t e r t b u t y l e t h e r s a s o x y g e n a t e f u e l sH O O O HO HnP o l y g l y c e r o l sM o n o g l y c e r i d eD i a c y l g l y c e r o lG l y c e r o l c a r b o n a t e1 , 2 P r o p a n e d i o l1 , 3 P r o p a n e d i o lG l y c e r o lA c r o l e i n A c r y l i c a c i dD i c h l o r o p r o p a n o lE i c h l o r o h y d r i nH y d r o x y p y r u v i c a c i dO x a i c a c i dT a r t r o n i c a c i dM e s o x a l i c a c i dG l y c e r a l d e h y d eG l y c e r i c a c i dD i h y d r o x y a c e t o n eO x i d a t i o nD e h y d r a t i o n O x i d a t i o nC h l o r i d a t i o nE t h e r i f i c a t i o nE t h e r i f i c a t i o nE s t e r i f i c a t i o nE s t e r i f i c a t i o nR e d u c t i o nR e d u c t i o nO x i d a t i o n甘油 二羥基丙酮 1,3丙二醇 1,3丙二醇 二羥基丙酮 副產(chǎn)物：甘油 分離濃縮 二級生物轉(zhuǎn)化 主產(chǎn)物：生物柴油 。發(fā)酵結(jié)束時 PGL 酶活達(dá)到 430 U/mL，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到 U/mL/h。 0 . 3 5 N . D . 重組 Tfu0883具有角質(zhì)酶活性 ? pET20b(+), pelB as signal peptide, Cterminal Histag ? E. coli BL21(DE3)Rossetta ? Ammonia sulfate precipitation, Nicolumn 角質(zhì)酶高產(chǎn)菌的構(gòu)建 舉例 3： 染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù) 42 調(diào)控 PGL發(fā)酵過程中底物甘油的濃度和誘導(dǎo)物甲醇的濃度，實(shí)現(xiàn) PGL的高產(chǎn)量和高生產(chǎn)強(qiáng)度 0123450 . 0 5 6 0 . 1 0 . 1 6 5 0 . 2 3甲醇 / D C W ( g / g )PGL (U/mL),PGL 生產(chǎn)強(qiáng)度 (U/mL/h),單位細(xì)胞產(chǎn)酶能力 (U/gcell)圖 23 甲醇和菌體濃度的比值對 PGL產(chǎn)量、 生產(chǎn)強(qiáng)度和單位細(xì)胞生產(chǎn) PGL的能力的影響 ■ PGL/100 PGL productivity □ PGL production per cell 1000 前期研究結(jié)果舉例： 甲醇和菌體濃度比值的影響 底物流加 研究目標(biāo) 流加策略 甲醇流加：控制甲醇流 速，將甲醇和菌體濃度比值維持在 g/g左右 甘油流加：細(xì)胞快速生長，達(dá)高密度； 重組 P. pastoris高密度發(fā)酵生產(chǎn) PGL的底物流加策略和溫度誘導(dǎo) 舉例 3： 染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù) 43 菌體生長階段的甘油流加策略 0 10 20 30 40 50 60 7002040608010002004006008001000DO (%)時間 (h)攪拌速率 (r/min) B0 10 20 30 40 50 60 70020406080100120140160020406080100DCW, 甘油 (g/L)時間 (h )流加速率 (mL/h) A 細(xì)胞干重在 63 h 達(dá)到 122 g/L 細(xì)胞干重在 33 h達(dá)到 140 g/L 0 5 10 15 20 25 30 35040608010002004006008001000DO (%)時間 (h)攪拌速率 (r/min) B0 5 10 15 20 25 30 35020406080100120140160020406080100120DCW, 甘油 (g/L)時間 (h )流加速率 (mL/h) ADOstat 指數(shù) 流加 重組 P. pastoris高密度發(fā)酵生產(chǎn) PGL的底物流加策略和溫度誘導(dǎo) 舉例 3： 染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù) 44 誘導(dǎo)階段的甲醇流加策略 0 24 48 72 96 1200100200300400500010203040506070DCW, 甲醇 (g/L), PGL (U/mL)時間 (h) DO (%), F (mL/h), qs (g/g DCW/h)圖 26 甲醇流加控制下的發(fā)酵過程曲線 ◆ DCW ? PGL □ Methanol — Feeding rate qs 1000 0 . 3 4 1 . 0 3 177。 0 . 2 3 1 . 3 3 177。 2 . 6 9 2 1 . 6 1 177。 2 . 8 9 2 4 . 8 9 177。 利用 代謝通量分析方法， 計(jì)算 得出胞內(nèi) 各條代謝途徑的通量變化 。 發(fā)酵優(yōu)化 18 分析 不同發(fā)酵產(chǎn)品合成途徑中 主要代謝節(jié)點(diǎn)的性質(zhì) ，結(jié)合發(fā)酵過程中胞內(nèi)能量代謝情況， 提出 一系列發(fā)酵優(yōu)化策略 。 3 . 7 1 9 H ex a de ce no i c a c i d 0 . 1 3 177。 4 . 0 9 9 O ct a d ec en o i c a ci d 1 . 7 4 177。 0 . 5 4 16 H y d r o x y h ex a de c a no i c a ci d 1 . 6 5 177。 0 . 3 2 1 . 5 2 177。 重組 P. pastoris高密度發(fā)酵生產(chǎn) PGL的底物流加策略和溫度誘導(dǎo) 舉例 3： 染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù) 45 舉例 4：透明質(zhì)酸發(fā)酵過程優(yōu)化與控制 透明質(zhì)酸三級結(jié)構(gòu) 優(yōu)良理化性質(zhì)：粘彈性 高保濕性 生物相容性 食品添加劑 關(guān)節(jié)炎治療 化妝美容 高粘度和低溶氧傳遞速率是 HA發(fā)酵過程的重要瓶頸 乳酸對細(xì)胞生長和 HA合成有著較強(qiáng)的抑制作用 細(xì)胞生長和 HA合成之間存在對碳源和關(guān)鍵輔因子的競爭 HA發(fā)酵存在問題 46 透明質(zhì)酸發(fā)酵過程的混合與傳質(zhì)特性優(yōu)化研究 問題 (Ⅰ) 高粘度和低溶氧傳遞速率是 HA發(fā)酵過程的重要瓶頸 溶氧水平 表觀黏度 有效攪拌區(qū)域體積 溶氧傳遞系數(shù) 0 nK? ? ???3 222fD P N DD r???? ???????? ?????? ????350 .0 0 1opP N N D r? ? ? ?(%) 100 cafTV T????????有效攪拌區(qū)域模型 0 5 10 15 200200400600C u l t u r e t i m e ( h )Agitation speed (rpm)0 5 10 15 200100200300400500C u l t u r e t i m e ( h )Broth viscosity (mPas)0 5 10 15 200204060C u l t u r e t i m e ( h )KLa (h1)0 5 10 15 200306090120C u l t u r e t i m e ( h )D