iywaaa生物技術(shù)制藥-(完整版)
【正文】 紹了體外培養(yǎng)法和動物體內(nèi)誘生法的具體步驟以及其它一些近來發(fā)展的方法。 四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定 ? （ 2）抗體性狀的鑒定 ? 由于不同類和不同亞類的免疫球蛋白生物學(xué)特性差異較大，諸如補體活化、免疫調(diào)理、 ADCC效應(yīng)等等，因此要對制備的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體，進(jìn)行 Ig類和亞類的鑒定，可用羊或兔抗Ig不同類和亞類的抗體，進(jìn)行免疫擴散或 ELISA法來鑒定。第一次克隆化時也要應(yīng)用 HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含 HT的 RPMI1640培養(yǎng)液。 ? 為了盡快地篩選出陽性克隆，必須采用微量、快速、特異、敏感、簡便并一次能檢測大批標(biāo)本的方法。由于 SP2/0等骨髓瘤細(xì)胞都是次黃嘌呤（ H） 鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (HGPRT） 缺乏株，脾細(xì)胞中卻有這種酶，因此脾 瘤融合的雜交瘤細(xì)胞可利用 HGPRT酶，用次黃嘌呤（ H） 和胸腺嘧啶（ T） 合成 DNA， 使雜交瘤細(xì)胞得以生長 二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 5）選擇性培養(yǎng)方法：通常將融合的細(xì)胞懸浮于 HAT的培養(yǎng)液（配方見書中表 42），加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的 96孔板內(nèi)，根據(jù)情況每 2~3天換液一次。但其粘度和對細(xì)胞的毒性也隨之增大。 一、抗原與動物免疫 ? （ 3）免疫方法：體內(nèi)免疫法和體外免疫法 ? 體外免疫法：用于不能采用體內(nèi)免疫法的情況下，如制備人源性單克隆抗體，或者抗原的免疫原性極弱且能引起免疫抑制時使用。目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來自 BALB/c小鼠和 Lou大鼠，因此免疫動物也多采用相應(yīng)的品系，最常用的也是BALB/c小鼠。它是結(jié)構(gòu)和特異性完全相同的高純度抗體。用于臨床治療，如針對 T淋巴細(xì)胞共有的分化抗原 CD3的單克隆抗體，用作免疫抑制劑。生物技術(shù)制藥 第四章 抗體制藥 第四章 抗體制藥 ? 第一節(jié) 概述 ? 第二節(jié) 單克隆抗體 ? 第三節(jié) 鼠源性單克隆抗體的改造 ? 第四節(jié) 基因工程抗體和抗體工程 ? 第五節(jié) 抗體診斷試劑 ? 第六節(jié) 抗體治療藥物 第一節(jié) 概述 ? 1890年： Behring和北里柴三郎等發(fā)現(xiàn)了白喉抗毒素，并建立了血清療法，開抗體制藥之先河。 ? 單克隆抗體還可作為載體制備導(dǎo)向藥物。制備的一般流程見下圖。 ? 選擇動物時應(yīng)考慮到動物品系的免疫應(yīng)答基因（ Ir） 對抗原免疫應(yīng)答的影響。 ? 體外免疫法所需要的抗原量少，一般只需幾個 ?g，免疫期短，僅 4~5天，干擾因素少，已成功制備出針對多種抗原的單克隆抗體，但融合后產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞株不夠穩(wěn)定。目前常用的 PEG的濃度為 40%~50%，相對分子質(zhì)量以 4000為佳。換液時吸去 1/2~2/3培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液。常用的檢測方法有免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)和放射免疫技術(shù)等。由于單個細(xì)胞難以存活，克隆化時也需加入飼養(yǎng)細(xì)胞輔助其生長。在單克隆抗體鑒定中還必須進(jìn)行親和力測定，它可為正確選擇不同用途的單克隆抗體提供依據(jù)。這里不一一介紹。 六、單克隆抗體的純化 ? 分離 ? （ 1）凝膠過濾 用于 IgG和 IgM類單克隆抗體的分離純化。 ? （ 3）親和層析 ? 多用蛋白 A親和層析，適用于 IgG類單克隆抗體的純化。如若用人 IgG1或IgG3的 C基因替換鼠 IgG1或 IgG2b， 則可有效地加強多肽的 ADCC效應(yīng)與免疫調(diào)理作用。也就是說，保留了 CDR區(qū)，而 Ig分子的 C區(qū)不表達(dá)。 它是一種非天然性的抗體，其結(jié)合抗原的兩個臂具有不同的特異性。其中較為成熟的是配基 Ig型嵌合蛋白，而酶 抗體型融合蛋白（即抗體酶， abeneyme） 在藥物治療中應(yīng)用前景廣闊，它可在靶向位置上將前體藥物轉(zhuǎn)化成有效的藥物，避免對正常組織的傷害，此法稱為抗體介導(dǎo)的酶前體藥物治療。 二、噬菌體抗體庫技術(shù)的特點 ? 模擬天然全套抗體庫 ? 抗體文庫 ?1011庫容，能包含 B細(xì)胞全部克隆。 ? （ 1）熒光抗體的制備 ? （ 2）免疫熒光測定法有直接和間接兩種方法。 ? （ 1）免疫酶染色法用抗體診斷試劑：常用的酶為 HRP， 其底物為二氨基聯(lián)苯胺（ DAB）， 兩者作用可生成棕褐色沉淀物質(zhì)，使抗原呈色。 VH和 VL隨機重組增加抗體的多樣性。在抗體的 N端和 C端融合其它蛋白都可以獲得成功。 ? 基因工程方法 采用適當(dāng)?shù)慕宇^連接不同抗體的 VH和 VL區(qū)，使它們不能形成鏈內(nèi)的分子內(nèi)配對，讓其形成原抗體的分子內(nèi)配對，構(gòu)建雙特異性（ SCFV)2。（ 2） FV抗體，由 VH和 VL組成，天然 FV片段中 VH和 VL為非共價性結(jié)合。 H和 L鏈各有三個 CDR， 其他部分稱為框架區(qū)。 用蛋白 A親和層析收獲的抗體純度很高，但也有極微量的雜蛋白。 ? （ 2）陰離子交換層析 用于
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