【正文】 Life Span，只有干細胞才有強的增殖生長能力，但這些細胞數(shù)量很少；④離體培養(yǎng)腫瘤細胞可能需求與體內(nèi)相似的特殊生存條件。在與正常組織混合培養(yǎng)時，能浸潤入其它組織細胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。事實上，多數(shù)腫瘤細胞初代培養(yǎng)時并不那么容易。癌細胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個細胞培養(yǎng)時，形成集落（克?。┑哪芰Ρ日＜毎麖?。根據(jù)活的增殖細胞能代謝 MTT 使 MTT 開環(huán) ,形成一種藍紫色的化合物甲 臢 沉積于細胞內(nèi)或細胞周圍 ,形的甲 臢 的量與細胞增殖程度成正比例關(guān)系 ,而建立的MTT 比色分析法。除上述提到的鉑、鈀、錫、鍺等，對常見的，如銅、鈷、鎳、鋅乃至釕、鍺甚至稀土等配合物無所不入。對 HL60、 L93 3T3 和 PAM4 種腫瘤細胞的活性順序為Pd2+Pt2+.對 PAM－ ras、 GLIOMA11 HeLa、 3T3 和 PAM 的活性，無論 Pd2+還是 Pt2+配合物，均好于 CisDDP。表 和表 分別給出了實驗結(jié)果。 我國學者對鈀配合物的抗腫瘤活性研究起步相對較晚。H2O [Pd(bipy)(gln)]Cl 33 第二節(jié) 鈀類抗腫瘤 配合物及其它金屬配合物 一、單核鈀配合物的抗腫瘤活性 1984 年， Gill 指出鈀配合物具有較好的抗腫瘤活性，自此掀起了鈀配合物在抗腫瘤活性方面的研究高潮。一般來說，脂溶性好、分子體積小的藥物容易穿過細胞膜。其中三核配合物 [Pt (Cl) (NH3)NH2 (CH2)6 NH2 Pt (NH3)2 NH2(CH2)6 NH2PtCl (NH3)2]4+已于 1998 年進入Ⅰ期臨床。通式為 PtCl2(L)(L180。二異丙胺合鉑；②、奧馬鉑（ ormaplatin） ,即四氯 奧沙利鉑全稱草 酸合鉑，由瑞士 Debiopharm 公司研制開發(fā)，法國 Sanofi 公司生產(chǎn)銷售，并于 1996 年在法國率先上市，我國于 1999 年批準奧沙利鉑針劑進口， 2020 年南京制藥廠研制開發(fā)國產(chǎn)奧沙利鉑獲國家藥檢局批準，命名為奧鉑。但 cisDDP在臨床應(yīng)用中也存在一些缺點，有較嚴重的毒副作用，如腎毒性、神經(jīng)毒性、耳毒性和胃腸道毒性等，又由于其溶解度較低，也限制 其使用。 28 圖 29 配合物 [Pd2(phen)2 (ade)2]的分子結(jié)構(gòu)圖 29 第三章 無機 抗癌 藥物 第一節(jié) 鉑配合物抗癌藥物 進展及其抗癌機理 一、 鉑配合物抗癌藥物 進展 第一代鉑藥物 1965 年美國密執(zhí)安州立大學科學家 等在研究電場對細菌生長的影響時偶然發(fā)現(xiàn)，在含 NH4Cl 的大腸桿菌培養(yǎng)液中用鉑電極通入直流電，大腸桿菌細胞分裂就會受到抑制，生長成相當于正常細胞 300 倍大的菌絲。 圖 28 為 對DNA 的切割電泳圖， M 為 Marker DNA ,1 為純 pBRDNA ,27 為向 pBRDNA加入一定量后 DNA 譜帶的變化。當帶電顆粒在電場中泳動時，受到兩種方向相反的力的作用 :電場力，摩擦力，而 DNA 通過瓊脂糖凝膠的電泳速率取決于以下 4 個主要參數(shù) : (1) DNA 分子大小線狀雙鏈 DNA 分子被認為是以一端向前方移動，它在凝膠基質(zhì)中的遷移速率與其堿基對數(shù)目以 10 為底的對數(shù)值成反比，分子越大，越 27 難于在凝膠中孔隙中蠕行，因而遷移得 越慢。 /DNA 復合物的 CD 光譜圖 ， a 為魚精 DNA，b、 c 為 配合物 /DNA 復合物的 CD，由圖可看出，當向 DNA 溶液中加入配合物后， DNA 的正負吸收均有增加，形狀并沒有發(fā)生變化，因而此化合物主要以插入作用與 DNA 發(fā)生了相互作用。 H2O 與魚精 DNA 發(fā)生嵌插作用的熒光光譜圖 。5H2O 與 DNA 作用的紫外光譜圖 24 二、熒光光譜法 熒光光譜作為一種快速、靈敏的譜學技術(shù)應(yīng)用于 DNA 與小分子相互作用的研究。減色效應(yīng)的強弱，能夠反映插入能力的大小，插入能力越強，減色效應(yīng)越強。主要表現(xiàn)為 DNA 的烷基化及 DNA 的鏈間交聯(lián)和鏈內(nèi)交聯(lián)等，與非共價結(jié)合相比， DNA 靶向分子與 22 DNA 共價結(jié)合序列特異性識別能力要強的多。 (3)嵌插結(jié)合 嵌插結(jié)合是藥物分子與 DNA 發(fā)生作用的重要形式之一。另外氫鍵、范德華力、疏水鍵等弱相互作用使配合物小分子通過溝內(nèi)或嵌插結(jié)合在 DNA的螺旋溝或堿基中，加上靜電力作用，會誘導許多生物效應(yīng)，阻礙核酸信息的正常表達。 20 世紀 80 年代，生物無機化學家在研究金屬離子與核酸的相互作用機制時，發(fā)現(xiàn)某些金屬配合物可作為 DNA 的結(jié)構(gòu)探針，用于判別 BDNA 和 Z 型 DNA。金屬 蛋白質(zhì)配合物的 結(jié)構(gòu)可分為兩類：一類是金屬離子與蛋白質(zhì)牢固結(jié)合在一起，金屬離子是蛋白質(zhì)的組成部分，當金屬離子移去或被取代后，金屬蛋白的活性將隨之失去。向內(nèi)的折疊形式。第二種力是互補堿基對間的氫鍵 ，它在使堿基形成特異配對時起重要作用。根據(jù)堿基構(gòu)象研究結(jié)果， A 與 T 配對形成兩條氫鍵， G 與 C 配對形成 3 個氫鍵（圖 112）。末端和一個 3180。鏈中每個核苷酸的 3180?！?， 3180。戊糖的第 1 個碳原子（ C1180。為了避免與堿基環(huán)上的 原子編號混淆，糖環(huán)碳原子編號通常加“ 180。所有這些劃時代的發(fā)現(xiàn)，無不改變?nèi)藗兊纳?，成為人們探索生命奧秘和創(chuàng)造最大財富的武器。氫鍵是維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)如 α螺旋 結(jié)構(gòu)、 β折疊結(jié)構(gòu) 等構(gòu)象的作 8 用力，如前所述，這種氫鍵不但存在于多肽鏈的鏈內(nèi)，而且鏈間的也存在大量的氫鍵。 CRCON HC RNHC OCRN HCORCN H2C RCON HCRC ONHC RCON HCRC O O 圖 14 β折疊結(jié)構(gòu) 三、 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)及四級結(jié)構(gòu) 多肽鏈首先在某些區(qū)域相鄰氨基酸形成有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)，然后以相鄰的二級結(jié)構(gòu)片段集裝成超二級結(jié)構(gòu)，進而折疊繞曲成結(jié)構(gòu)域，由兩 個或兩個以上的結(jié)構(gòu)域組裝成三級結(jié)構(gòu)。 α螺旋 體的結(jié)構(gòu)允許所有肽鍵都能參與鏈內(nèi)氫鍵的形成，正是由于氫鍵的作用， α螺旋 的構(gòu)想非常穩(wěn) 定。 6 H N C H C O N H C H C O N H C H C OR 1 R2H N C H C O N H C H C O N H C H C OR 3 R4C H 2SSC H 2 S SS S 圖 13 蛋白質(zhì)肽鏈中和肽鍵間二硫鍵示意圖 二、 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)分子的多肽鏈并非呈直線伸展，而是盤曲和折疊成特有的空間構(gòu)象。 肽鏈中的肽鍵是由一個氨基酸的氨 基與另一個氨基酸的羧基縮合去一個水分子而成。除含有碳、氫、氧、氮外，含有少量的硫。生物體中，特別是在細菌中也有 D型氨基酸。按照軟硬酸堿理論，氨基酸具有堿性較強的氨基及堿性較弱的羧基，故氨基酸具有很強的 配位能力，能與大多數(shù)過渡及稀土元素形 成配合物 。 一、 氨基酸的結(jié)構(gòu)通式 自然界中已發(fā)現(xiàn)氨基酸有上百種，但從蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中分解出來的氨基酸通常只有 20 種，而且這些 氨基酸，除脯氨酸外，具有相似的結(jié)構(gòu)單元，均為 α氨基酸，即羧酸分子中 α碳原子 的一個氫原子被氨基取代而成的化合物。 D型氨基酸和 L型氨基酸結(jié)構(gòu)式如圖 12 所示。不同蛋白質(zhì)的含氮均有一定的比例，這是蛋 白質(zhì)的一重要特點。下圖為蛋白質(zhì)中多肽鏈一個片斷的結(jié)構(gòu)通式，表示氨基酸的種類、連接方式和排列順序。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)指多肽鏈盤曲折疊方式。螺旋體內(nèi)氫鍵形成示意圖如下： H C C OH NR 3NHCO α螺旋 結(jié)構(gòu)有左手螺旋和右手螺旋兩種，天然蛋白質(zhì)的 α螺旋 絕大多數(shù)為右手螺旋。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈上的所有原子在三維空間的分布。疏水鍵是指多肽鏈上疏水性較強的氨基酸如纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等具有芳環(huán)或雜環(huán)等疏水側(cè)基可以避開水而相互聚集在一起，形成孔穴，對維持蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)起著重要作用。 2020 年，美、英、日、法 、 德和中國科學家宣布共同完成了人類基因組序列的測試工作，這是繼發(fā)現(xiàn)DNA 結(jié)構(gòu)后生命科學中的又一里程碑，標志著人類基因組時代的到來。” 。）通常與嘌呤堿的第 9 個氮原子或嘧啶堿的第 1 個氮原子相連?！?， 5180。羥基和相鄰核苷酸的戊糖上 5180。末端。由于堿基對的大小基本相同，所以無論堿基序列如何，雙螺旋 DNA 分子整個長度的直徑相同，螺旋直 徑為 2nm。第三種力是磷酸殘基上的負電荷與介質(zhì)中的陽離子之間的形成的離子鍵，因為在生理 pH 條件下， DNA 帶有大量負電荷，如果沒有陽離子與它成鍵，由于自身不同部位的負電荷間的排斥作用，將使DNA 非常不穩(wěn)定。 A 型 DNA 也是右手螺 旋結(jié)構(gòu)，但堿基中的糖環(huán)取 C3180。在這一類金屬蛋白質(zhì)中，金屬與蛋白質(zhì)之比為一恒定常數(shù)，金屬與蛋白質(zhì)組成一個穩(wěn)定的配合物。 BDNA 的疏水型堿基位于螺旋的內(nèi)側(cè)，具有親水性的磷酸二酯鍵形成多聚核苷酸為主鏈外側(cè)，由于 ZDNA 中堿基鳥嘌呤的 C8 和 N7 暴露于雙螺旋的外側(cè)，受保護程度小，容易受化學致癌劑攻擊而引起化學反應(yīng)，因此， ZDNA 可能與突變、基因表達和調(diào)控有關(guān)。 圖 21 DNA 與小分子的非共價結(jié)合的三種模式 (1)外部靜電結(jié)合 核酸是一個高度帶電的聚合電解質(zhì)，它的陰 離子磷酸根部分強烈地影響DNA 的構(gòu)象及其反應(yīng)。它是以平面或幾乎平面的芳香雜環(huán)嵌入 DNA 的堿基對中如圖 （ 3） 。小分子與特定堿基作用并形成加合物，使 DNA 雙鏈解旋并彎曲。與 DNA 發(fā)生插入作用后的配合物，插入配體與 DNA 堿基對間發(fā)生π電子堆積后，配合物的配體共軛性加強，產(chǎn)生紅移現(xiàn)象，紅移程度反映出插入能力的大小?？筛鶕?jù)兩者相互作用前后熒光強度的變化判斷小分子與 DNA 的作用 模式。 a 為 配合物的熒光光譜， be 為 向配合物的溶液中滴加 DNA的熒光光譜 , 由圖可看 出 隨 DNA 量的增加，配合物熒光強度逐漸增強，這是由于配合物插入 DNA 后， DNA 堿基對的疏水環(huán)境對配合物熒光發(fā)光具有保護作用，從而證明配合物與 DNA 發(fā)生了 嵌插作用。 26 圖 27 魚精 DNA 及配合物 [Pd(Ltyr)2] (2)瓊脂糖凝膠濃度同樣大小的 DNA片段在不同濃度瓊脂糖凝膠中遷移速率不同。其中， Ⅰ為超螺帶，Ⅱ缺口環(huán)化帶，Ⅲ線性帶。但更換其它電極就觀察不到這種現(xiàn)象。 第二代鉑藥物 卡鉑 為了克服順鉑在臨床上的缺點，科學家們研制出第二代鉑類抗腫瘤藥物 卡鉑，其分子結(jié)構(gòu)式見圖 。 奧沙利鉑作為一種穩(wěn)定的、水溶性鉑類烷化劑，是第一明顯對結(jié)腸癌有效以及在體內(nèi)外均有光譜抗腫瘤活性的鉑類抗腫瘤藥物，它對耐順鉑的腫瘤細胞亦有較好的抑制活性。環(huán)己二胺合鉑；③、 JM216（ Saraplatin），即二氯 )的三個系列反式配合物： (1) L= L180。另有一些脂肪二胺橋聯(lián) Pt(Ⅱ )雙核、三核、四核和涉及硫脲、精胺、亞精胺配合物也具有顯著的活性，開辟了多核配合物研究領(lǐng)域。鉑 族抗癌藥物均含有氨或胺，整個分子為電中性，有一定的脂溶性，同時分子體積比有機藥物小，所以容易跨膜運轉(zhuǎn)進入細胞。較早系統(tǒng)開展這方面工作是印度科技大學和孟買腫瘤研究所的科技人員。2H2O [Pd(bipy)(asp)] [Pd(bipy)(glu)]Cl畢瓊斯等研究了 34 [Pd(phen)(Aa)]Cl 型配合物對 Raji、 MCF7 細胞的毒性，對 S180 實體瘤株的抑制也進行了研究，得到較好的 實驗結(jié)果。雙核配合物的結(jié)構(gòu)見圖 。 三、釕配合物抗癌活性 大量研究表明，釕配合物具有低毒性、易吸收、排泄快等優(yōu)點，是最有前途的抗癌藥物之一。這些化合物不僅結(jié)構(gòu)多樣，對多種腫瘤細胞表現(xiàn)出較強的抑制能力，并具有規(guī)律性，為開發(fā)研制新型無機藥物分子提供了有價值的信息。該法具有不涉及使用放射性元素 ,所用試劑少 ,儀器簡單 ,耗時少 ,出結(jié)果快 ,結(jié)果與同位素摻入法一致等優(yōu)點 ,適用于大量抗癌藥物的篩選 ,抗癌作用機理的探討研究以及指導臨床合理用藥。另外癌細胞增殖數(shù)量增多擴展時，接觸抑制消除，細胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。生長增殖并不旺盛；經(jīng)過純化成單一化瘤細胞后，也大多增殖若干代后，便出現(xiàn)類似二倍體細胞培養(yǎng)中的停滯期。 異質(zhì)性 所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細胞組成。 二、 腫瘤 細胞培養(yǎng)技術(shù) 、 細胞傳代培養(yǎng) 細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。 (2). 顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質(zhì)回縮，細胞之間 41 不再連接成片，表明此時細胞消化適度。 、 分裝稀釋細胞 將細胞懸液吸出按 1： 3～ 5 分裝至新培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋，做好標記。傳代細胞約 2 小時后開始貼附在瓶壁上。一般室溫消化時間約為 1— 3 分鐘。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需 經(jīng)消化后