【正文】 品：如酶蛋白，除具有一定氨基酸排列的一級結(jié)構(gòu)外，還具有一定立體構(gòu)象的二、三級結(jié)構(gòu)，甚至于四級結(jié)構(gòu)，才呈現(xiàn)出生物活性。 生物工業(yè)下游技術(shù)大致可分為 4 個階段 (1)預(yù)處理和固液分離： 固液分離以除去發(fā)酵液中的不溶性固形物雜質(zhì)和菌體細(xì)胞。 2．子代分離技術(shù) 各種分離純化技術(shù)相互結(jié)合、交叉、滲透，形成子代分離技術(shù)。 Cell biology。 2．?dāng)M平衡 (速度差 )分離操作 在混合物體系本身所占有的空間之外加一個能引起物質(zhì)分離的勢能場，在它的作用下，形成分離場。 5．液液平衡 XA rB 分配系數(shù) K=—— = —— XB rA XA ,XB — 溶質(zhì)在 A、 B 兩相的平衡濃度。但從工業(yè)生產(chǎn)角度，達到適當(dāng)平衡度即可。 2．固相內(nèi)的分子擴散 如浸取操作。 在多孔性粒子的充填層內(nèi)，粒子間的一次空隙與粒子內(nèi)的二次空隙構(gòu)成二元結(jié)構(gòu)細(xì)孔網(wǎng)絡(luò)。 如果在萃取溶劑中加入對原料中 目標(biāo)物質(zhì)有特異性作用的成分 (萃取劑、抽提劑 )，能達到高選擇性。 “皇冠醚 ” 皇冠醚有多種 ，均為大環(huán)狀化合物。 第三節(jié) 下游技術(shù)中的生物學(xué)過程 一、特異性相互作用 (鎖鑰關(guān)系） （一）可逆性結(jié)合作用（除共價結(jié)合外） 1．離子間的相互作用 2．氫鍵結(jié)合 3．硫水性相互作用 4．對金屬原子配傷 5．弱共價鍵結(jié)合 影響蛋白質(zhì)立體構(gòu)象的環(huán)境因素 ： (1)熱： 熱是影響蛋白質(zhì)構(gòu)象的最普通的因素。 11 授 課章節(jié) 第三章 發(fā)酵液預(yù)處理 學(xué)時 2 教學(xué)目標(biāo)與要求 1. 掌握發(fā)酵液過濾特性的改變的方法 2. 掌握發(fā)酵液的相對純化的方法 3. 掌握固液分離工程及設(shè)備 教學(xué)重點與難點 1. 凝聚與絮凝； 。 改善發(fā)酵液過濾特性的物理化學(xué)方法 ： 通過對發(fā)酵液進行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，即可改善其流體性能，降低濾餅比阻，提高過濾與分離的速率。 絮凝劑：是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質(zhì)量可高達數(shù)萬至一千萬以上，它們具有長鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團，包括帶電荷的陰離子或陽離 子基團以及不帶電荷的非離子型基團。 13 第三節(jié) 固液分離工程及設(shè)備 范圍：培養(yǎng)基、發(fā)酵液、某些中間產(chǎn)品和半成品。 1．碟片式離心機 2． 管式離心機 3．傾析式離心機 二、過濾 原理：懸浮液通過過濾介質(zhì)時，固態(tài)顆粒與溶液分離。硅藻土不規(guī)則粒子間形成許多曲折的毛細(xì)孔道，藉篩分和吸附作用除去懸浮液中的固體 粒子。 2．雙水相萃取 3．吸附法：優(yōu)點在于設(shè)備簡單、能耗低，主要的問題是很難選擇合適的吸附劑，以保證目的產(chǎn)物不致于被吸附而損失。因此細(xì)胞破碎是提取胞內(nèi)產(chǎn)物的關(guān)鍵步驟。 在機械破碎法中，由于稍耗的機械能轉(zhuǎn)為熱量會使溫度上升，在大多數(shù)情況下要采用冷卻措施，以防止生物產(chǎn)品受熱破壞。 優(yōu)點：操作簡便，液量損失少，適合實驗室規(guī)模。 (2)EDTA 螯合劑 ： 革蘭氏陰性菌的外層膜結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子 Ca2+或 Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，一旦 EDTA 將 Ca2+或 Mg2+ 螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。 (3)有些化學(xué)試劑有毒性，在其后的產(chǎn)物提取精制過程中需設(shè)法分離除去。 一、溶劑萃取過程的理論基礎(chǔ) 1．物質(zhì)的溶解和相似相溶原理 從熱力學(xué)角度考慮，一個過程要能自動進行，體系的自由能應(yīng)下降，自 由能的變化包括焓變化和嫡變化兩部分： 為了簡單起見，忽略嫡的變化，井忽略壓力和體積變化 (一般溶解過程壓力和體積的變化很小 )，這樣只要考慮體系能量的變化即可。 (1)N 型溶劑 不能形成氫鍵，如烷烴、四氯化碳、苯等 ,稱惰性溶劑。在生物工業(yè)上，對后一點考察較多的是分子極性。 分離因數(shù) (β ) 萃取劑對溶質(zhì) A 和 B 分離能力的大小可用分離因數(shù) (β )來表征： 若原來料液中除溶質(zhì) A 以外，還含有溶質(zhì) B，則由于 A、 B 的分配系數(shù)不同，萃取相中 A 和 B的相對含量就不同于萃余相中 A 和 B 的相對含量。 (2)溫度 溫度會影響生化物質(zhì)的穩(wěn)定性，所以一般在室溫或低溫下進行。 （ 2）多級逆流萃取，特點：萃取劑消耗少，萃取液產(chǎn)物平均濃度高，產(chǎn)物收率最高。 最好的方法是防止乳化，如蛋白質(zhì)是乳化起因，就應(yīng)設(shè)法去除蛋白質(zhì)。 物質(zhì)之間的溶解能力主要取決于物質(zhì)分子之間的相似性，一是分子結(jié)構(gòu)相似，二是分子間的作用力相似。 ２、萃取溶劑 CO2 的性質(zhì)： 無毒，無腐蝕性，不可燃燒，純度高且價格低。溶質(zhì) 2 在氣相中的逸度系數(shù) ?2 對其影響最大；溶質(zhì)與溶劑之間相互作用能越大， E 就越大。 ② SC—CO2 對細(xì)胞壁中的少量脂類有萃取作用，會破壞細(xì)胞壁的化學(xué)結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞壁在某些位置上的損壞。 嫡的增加涉及到分子數(shù)量，與分子大小無關(guān)。雙節(jié)線下方為一相區(qū)，雙節(jié)線上方即為兩相區(qū)，兩相分別有不同的組成和密度。 雙水相提取胞內(nèi)酶的具體操作 基本流程：（圖、表） 1 ． 萃取和平衡 2．上下相的分離 (1)重力沉降 (2)離心分離（圖） 3．多聚物的分離 三、 雙水相蘋取技術(shù)的發(fā)展 雙水相萃取應(yīng)用得最多的是胞內(nèi)酶的提取。其親水性的極性端向外指向水溶液，疏水性的非極性 “尾 ”向內(nèi)相互聚集在一起。 (圖 ) 五、 在液膜分離法中的應(yīng)用 利用含有反膠團的有機相作為液膜，從一水相中向另一水相擇性地輸送生理活性物質(zhì)的液膜分離方法，和通常的液液 萃取法相比，具有以下一些特征： 正萃取和反萃取能同時在一個裝置內(nèi)進行； 表面活性劑的使用量及其損失較少； 從原理上來看，速度差分離也是可能的。 一般而言．第一、二兩步都很迅速，不是浸取過程總速率的控制性步驟。 Cell theory 研究進展和參考資料 韓貽仁．分子細(xì)胞生物學(xué)．第二版．北京：科學(xué)出版社， 2020 汪堃仁，薛紹白，柳惠圖．細(xì)胞生物學(xué)．第二版．北京：北京師范大學(xué)出版社， 1998 課后復(fù)習(xí)題 縱觀 cell biology 發(fā)展簡史，你認(rèn)為該學(xué)科近百年來快 速發(fā)展的主要原因是什么？ 27 第六章 沉淀法和吸附法 第一節(jié)、沉淀法 一、鹽析法； 二、有機溶劑沉淀法； 三、等電點沉淀法； 四、生成鹽復(fù)合物沉淀法。 IogS＝ 223。但在高鹽濃度中，蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)的溶解度隨溫度的升高反而減小。 缺點：酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活，因為蛋白質(zhì)對低 PH 比較敏感。 溫度：降低溫度可以增加收率。利用 檸檬酸鈣難溶于水的特點，與雜質(zhì)分離的過程。 吸附作用力也是范德華力．它是一組分子引力的總稱，包括三種力，即定向力、誘導(dǎo)力。 生產(chǎn)設(shè)備及操作 1）調(diào)漿：調(diào)漿罐， 30—50%濃度； 2）中和：中和罐，濾液、鈣漿泵入，攪拌， 7090℃ ，控制 終點； 3）過濾：過濾槽、帶式過濾機， 90℃熱水逆流洗滌； 4）酸解：酸解罐，攪拌，稀酸調(diào)漿，加熱，加硫酸，控制終點； 5）過濾：過濾槽、帶式過濾機， 90℃熱水逆流洗滌，至 PH 大于 4。因此在接近等電點處，以引起沉淀所需有機溶劑的量較少。其主要作用是降低水溶液的介電常數(shù)。由于蛋白質(zhì)在等電點時最易沉淀，可選擇等電點的 PH 作為鹽析的 pH。值 —是溶質(zhì)的特征常數(shù)，對于蛋白質(zhì)而言，其大 小主要取決于不同蛋白質(zhì)的性質(zhì)，它也與溶液的溫度和 pH 值有關(guān)，但與鹽的種類無關(guān)； 為便于計算，用鹽的摩爾數(shù) m 代替離子強度Ⅰ，則 IogS＝ 223。 優(yōu)點：成本低、設(shè)備簡單、收率高、濃縮倍數(shù)高和操作簡單。 三、浸出的其他問題 25 1．相平衡 浸取過程中的相平衡用分配系數(shù) KD 表示 KD ＝ y / x y——達到平衡時溶質(zhì)在濃相中的濃度 x——平衡時溶質(zhì)在固相中的濃度 2．溶劑的選擇 KD 大且對目的物質(zhì)的選擇性高，溶劑的價格應(yīng)低廉，無腐蝕性，無毒，閃點高，無爆炸性，產(chǎn)品中易去除 ,容易回收。 有研究表明，用容積 (Bulk)液膜的形式，反膠團萃取分離蛋白質(zhì)和核酸是可能的。與在水相中不同的是，其疏水性的非極性尾部向外，指向非極性溶劑，而極性頭向內(nèi)，與在水相中形成的微膠團方向相反，因而稱之為反膠團或 反向膠團。 PEG 衍生物：在 PEG 上引入親和基團或離子基團；采用多級萃取。由圖 72 可知，上相主要含 PEG， 下相主要含 Dex。 分子間的作用力可看作分子中各基團間相互作用力之和。 ③ SC—CO2 節(jié)流膨脹是吸熱降溫過程，這個性質(zhì)可防止通常破碎過程升溫而引起的熱敏性物質(zhì)的破壞。代表性的三種流程的模式圖。 四、 SC—C02 萃取以及拖帶劑的作用 １、 SC—C02 萃?。? 天然產(chǎn)品中通常含有許多不同的化學(xué)成分；對同一天然產(chǎn)品用不同方法或不同萃取劑提取得到的制品，其組分是不同的。真空或萃取劑分子密度極低，溶劑對溶質(zhì)的作用能極小，溶質(zhì)的溶解度也就極小了?；旌?、萃取和分離也可在同一臺設(shè)備 (如 Alfa—Laval 萃取機 )內(nèi)完成。 害處：乳化產(chǎn)生后會使有機溶劑相和水相分層困難，發(fā)酵液廢液中夾帶有機溶劑微滴和溶劑相中央帶發(fā)酵液的微滴，前者意味著發(fā)酵單位的損失；后者會給以后的精制造成困難 。 (3)鹽析 硫酸銨、氯化鈉等可降低產(chǎn)物在水中 的溶解度，有機溶劑在水相中的溶解度。 β 越大， A、 B 的分離效果越好，即產(chǎn)物與雜質(zhì)越容易分離。物質(zhì)的介電常數(shù)可通過測定該物質(zhì)在電容器 二極板間的靜電容量 C 來決定。 (3)B 型溶劑 只有電子供體的溶劑，如酮、醛、醚、酯等，萃取溶劑中的 TBP(磷酸三丁酯 )、叔胺 19 等。此過程需要吸收能量，這種能量的大小通常與分子之間的作用力有關(guān)，一般順序為： 非極性物質(zhì)＜極性物質(zhì)＜?xì)滏I物質(zhì)＜離子型物質(zhì) (2)溶劑 A 在溶質(zhì) B 的作用下形成可容納 B 質(zhì)點的空位；此過程也需要吸收能量，其大 小與溶劑分子 A 之間的相互作用力有關(guān)，一般順序與上述相同： 非極性物質(zhì)＜極性物質(zhì)＜?xì)滏I物質(zhì) 該能量還與溶質(zhì)分子 B 的大小有關(guān)。 教學(xué)方法 講授；多媒體教學(xué) 主要 教學(xué)內(nèi)容 Section 1: 溶劑萃取法 ◆ 溶劑萃取過程的理論基礎(chǔ) ◆ 工 業(yè)萃取方式和理論收得率 ◆ 乳化和去乳化 Section 2: 超臨界流體萃取法 ◆ 超臨界流體的蘋取原理 ◆ 超臨界 CO2 的溶劑特征 ◆ SC— C02 萃取以及拖帶劑的作用 ◆ 超臨界流體萃取的熱力學(xué)基礎(chǔ) ◆ SC— C02 萃取流程及在生物、食品工業(yè)中的應(yīng)用 Section 3: 雙水相萃取法 ◆ 雙水相分離理論 ◆ 雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用 Section 4: 反膠團萃取法 ◆ 反膠團的形成 ◆ 生理活性物質(zhì)的分離農(nóng)縮 ◆ 在分離工藝中的應(yīng)用 Section 5: 浸取法 ◆ 浸取過程的應(yīng)用 ◆ 浸取速率 需掌握的專業(yè)詞匯 Cell。 (3)有機溶劑 ： 能分解細(xì)胞壁中的類脂。 四、酶溶法 利用酶反應(yīng) ,分解破壞細(xì)胞壁上的特殊鍵，從而達到破壁的目的。 目前人們?nèi)栽谔綄ば碌募?xì)胞破碎方法。 一、細(xì)菌細(xì)胞壁主要化學(xué)成分：肽聚糖；主要阻力膿聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 教學(xué)方法 講授；多媒體教學(xué) 主要 教學(xué)內(nèi)容 Section 1: 細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu) ◆ 細(xì)菌細(xì)胞壁主要化學(xué)成分 ◆ 酵母 細(xì)胞壁主要化學(xué)成分 ◆ 霉 菌細(xì)胞壁主要化學(xué)成分 Section 2: 細(xì)胞壁的常用破碎方法 ◆ 珠磨法 ◆ 高壓勻漿法 ◆ 超聲破碎法 ◆ 酶溶法 ◆ 化學(xué)滲透法 Section 3: 破碎率的測定與破碎技術(shù)的研究方向 ◆ 破碎率的測定 ◆ 破碎技術(shù)的研究方向 需掌握的專業(yè)詞匯 Cell。 (3)將適當(dāng)?shù)墓柙逋练稚⒃诖^濾的懸浮液中，使形成的濾餅具有多孔隙性，降低濾餅的可壓縮性，以提高過濾速率和延長過濾操作的周期。 澄清過濾：所用的過濾介質(zhì)為硅藻土、砂、顆?；钚蕴?、玻璃珠、塑料