原位雜交與凋亡檢測技術(shù)(完整版)
【正文】 片和組織處理，增強(qiáng)核酸探針的穿透性，減低背景染色等。 （四）、增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性： Triton X100 蛋白酶 K（ Proteinase K 1ug/ml） 37 0C 15~20 min 胃蛋白酶（ Pepsin 20~100ug/ml） 37 0C 30 min 上述酶消化后用 4%多聚甲醛后固定。 組織切片置于盛有 2 SSC溶液的濕盒中孵育。 吸收試驗：用 cDNA或 cRNA探針進(jìn)行預(yù)雜交。 DNA雜交： 切片置于 2 SSC中，微波爐加熱 95~ 100℃ 10分鐘；迅速插入冰水 2分鐘； DNA探針于 90 ℃ 水中 10分鐘 ,迅速插入碎冰 3分鐘； 雜交：切片在空氣干燥后，按每張切片加 20μl含地高辛標(biāo)記的 DNA/RNA探針原位雜交液，將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上，恒溫箱 37 ~ 400C過夜。 1 PBS洗 5分鐘 3次。 （ 2）陽性著色強(qiáng)度：按弱、中、強(qiáng)三 級分別為 3分。 用不同的顯色液，一般先用 DAB, 后用 CIP/NBT顯色，分別顯成棕黃色和紫藍(lán)色。 *細(xì)胞凋亡時內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細(xì)胞自身的染色質(zhì)或 DNA被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與 DNA斷點數(shù)目相同的 3’ — OH末端；利用末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶將地高辛標(biāo)記的 dUTP結(jié)合在 3’ — OH末端，再通過酶聯(lián)反應(yīng)，最后用顯色劑予以顯色。圓形 或卵圓形、大小不等，胞漿濃縮，強(qiáng)嗜酸性， 可有或無固縮深染的核碎片。 （ 2）掃描電鏡：細(xì)胞呈波浪狀或細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)改變，如偽足，微絨毛消失等。 2．標(biāo)記步驟： 試劑盒內(nèi)容： ① 標(biāo)記緩沖液（ Labeling Buffer） 1ml ② 蛋白酶 K(Proteinase K)100ul ③ 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（ TdT, 20） 20ul ④ DIGdUTP( 20) 20ul ⑤ 封閉液（ Blocking Reagent） 2ml ⑥ 生物素化抗地高辛抗體（ 100） 20ul /堿性磷酸酶抗地高辛抗體 ⑦ SP試劑（ 100） 20ul 自備：顯色液： DAB或 BCIP/NBT。 The End 。 Tunel染色法： 陽性部位定位于細(xì)胞核。（檢測凋亡細(xì)胞的特異性手段）。 熒光染料： PI(propidium iodide) 5~10ug/ml DAPI（ 4’， 6’— diamidino2phenylindole） 1~2/ug/ml 7AAD(7aminoactinomycin D) 10~20/ ug/ml Hoechst 33342（ + 雙蒸 10ml） /PI 雙染色。 三、凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)： 普通光學(xué)顯微鏡下形態(tài)： 組織處理：一般無特殊。 腎小管細(xì)胞核 HBVDNA， 細(xì)胞質(zhì) HBsAg 雙（ +）， ISHIHC 肝細(xì)胞 HBVDNA ， HBsAg 雙（ +）， ISHIHC 原位雜交是一個很復(fù)雜的操作過程，許多條件不好掌握。 七、原位雜交結(jié)合免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記法： 原位分子雜交檢測 DNA或 RNA， 能進(jìn)行基因定位或在轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達(dá)； 免疫組織化學(xué)檢測細(xì)胞和組織內(nèi)蛋白抗原 成分，在翻譯水平上研究基因表達(dá)。 1 PBS 洗 5分鐘 4次。 滴加雜交探針穩(wěn)定液 37400C 反應(yīng)46小時（此步可省略）。 空白試驗：用未標(biāo)記探針或不加探針 的雜交液進(jìn)行雜交。 鹽溶液（ SSC） 濃度由高到低，溫度
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