【正文】 1 STE： ， 10mmol/L Tris氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開 ,異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。 RNA 酶 A 母液：將 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L TrisCl()溶液配制成 10mg/ml,并分裝成小份 (如 )保存于 20℃ ,每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。如果質(zhì)粒 DNA 兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂 ,分子就能旋 轉(zhuǎn)而消除鏈的張力 ,形成松馳型的環(huán)狀分子 ,稱開環(huán) DNA(Open circular DNA, 簡稱 ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA 的兩條鏈在同一處斷裂 ,則形成線狀 DNA(Linear DNA)。常用的質(zhì)粒載體大小一般在 1kb 至 10kb 之間，如 PBR32 PUC 系列、 PGEM 系列和 pBluescript（簡稱 pBS）等。 利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共同存在 ,當(dāng)兩種質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入同一細(xì)胞時(shí) ,它們在復(fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過程中彼此競爭 ,在一些細(xì)胞中 ,一種質(zhì)粒占優(yōu)勢 ,而在另一些細(xì)胞 中另一種質(zhì)粒卻占上風(fēng)。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力 ,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù) ,并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某 些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能存活 ,而宿主即使沒有它們也可以正常存活。當(dāng)細(xì)胞生長幾代后 ,占少數(shù)的質(zhì)粒將會(huì)丟失 ,因而在細(xì)胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種，這種現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性 (Inpatibility)。 從細(xì)菌中分離質(zhì)粒 DNA 的方法都包括 3 個(gè)基本步驟 :培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞 。當(dāng)提取的質(zhì)粒 DNA 電泳時(shí) ,同一質(zhì)粒DNA 其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動(dòng)速度快。 3mol/l NaAc ()： 50ml 水中溶解 NaAcCl(), 15mmol/L NaCl 中 ,配成 10mg/ml的溶液 ,于 100℃ 加熱 15 分鐘 ,使混有的 DNA 酶失活。 按體積 /體積＝ 1:1 混合上述飽和酚與氯仿即得酚 /氯仿 (1:1)。Cl()， 1mmol/L EDTA ()。 棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。 2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度 ,濃度高時(shí) ,細(xì)菌裂解效果反而不好。 上清液移入干凈 eppendorf 管中 ,加入等體積的酚 /氯仿 (1:1),振蕩混勻 ,4℃ 下 12020g 離心 5 分鐘。沉淀 DNA 也可用異丙醇 (一般使用等體積 ),且沉淀完全 ,速度快 ,但常把鹽沉淀下來 ,所以多數(shù)還是用乙醇。 4℃ 下 12020g 離心 5 分鐘，取上清液于新的 eppendorf 管中。 三、質(zhì)粒 DNA 的大量提取和純化 在制作酶譜、測定序列、制備探針等實(shí)驗(yàn)中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒 DNA,為此需要大量提取質(zhì)粒 DNA。 4℃ 下 5000g 離心 15 分鐘。 2. 加入溶液 II 和溶液 III 后操作應(yīng)混和 ,切忌劇烈振蕩。 14000g,2225℃ 離心 15 分鐘。 1將樹脂 /DNA 混合液抽干后 ,加 13ml 柱子洗脫溶液至離心管中 , 對管底部的樹脂 /DNA 進(jìn)行 6 洗脫 (柱子一邊旋轉(zhuǎn)一邊加入洗脫液 )，并加入柱子中。 2. 純化樹脂必須混勻后再用 . （三）、 Sephrose 2B 柱純化質(zhì)粒 DNA 堿法提取的質(zhì)粒 DNA 即使用 RNA 酶處 理 ,仍會(huì)含有少量 RNA。通常質(zhì)粒 DNA 在柱上流出的第一個(gè)峰中。 它可分為三類 :Ⅰ 類和 Ⅲ 類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾 (甲基化 )作用且依賴于 ATP 的存在。 Ⅱ 類酶切割位點(diǎn)在識別序列中 ,有的在對稱軸處切割 ,產(chǎn)生平末端的 DNA 片段 (如 SmaⅠ :539。 339。若兩者可用同一緩沖液 ,則可同時(shí)水解。 在酶切圖譜制作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般 DNA 用量約為 。 瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。在電場中 ,在中性 pH 值下帶負(fù)電荷的 DNA 向陽極遷移 ,其遷移速率由下列多種因素決定 : DNA 的分子大小 : 線狀雙鏈 DNA 分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與 DNA 分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。 電源電 壓 在低電壓時(shí) ,線狀 DNA 片段的遷移速率與所加電壓成正比。 重組 pBS 質(zhì)料或 pUC19 質(zhì)粒 。 第三節(jié) 操作步驟 一、 DNA 酶切反應(yīng) 將清潔干燥并經(jīng)滅菌的 eppendorf 管 (最好 )編號 ,用微量移液槍分別加入 DNA 1μg和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng) 10緩沖液 2μl,再加入重蒸水使總體積為 19μl,將管內(nèi)溶液混勻后加入 1μl酶液 ,用手指輕彈管壁使溶液混勻 ,也可用微量離心機(jī)甩一下 ,使溶液集中在管底。 EcoRI 切割 lDNA 后得到 6 個(gè)片段 ,長度 分別為 , , , , 和 。用移液器吸取少量融化的 瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè) ,待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi) ,使膠液形成均勻的膠層?？刂齐妷罕３衷?6080V,電流在 40mA 以上。以核苷酸數(shù)的常用對數(shù)為縱坐標(biāo) ,以遷移距離為橫坐標(biāo) ,在坐標(biāo)紙上繪出連結(jié)各點(diǎn)的平滑曲線 ,即為該電泳條件下 DNA 分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 市場銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時(shí)可事先用酶反應(yīng)緩沖液（ 1）進(jìn)行稀釋。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源 DNA。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的 OD600 來控制。 4. 防止雜菌和雜 DNA 的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行 , 所用器皿 , 如離心管 , tip頭等最好是新的 ,并經(jīng)高壓滅菌處理 ,所有的試劑都要 滅菌 ,且注意防止被其它試劑、 DNA 酶或雜 DNA所污染 , 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜 DNA 的轉(zhuǎn)入 , 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入 pBS，則在含 Amp 的培養(yǎng)基上不能生長。 (Maconkey Agar):取 52g麥康凱瓊脂 ,加蒸餾水 1000ml,微火煮沸至完全溶解 ,高壓滅菌，待冷至 60℃ 左右加入 Amp 儲(chǔ)存液使終濃度為 50ug/ml,然后搖勻后涂板。 感受態(tài)細(xì)胞分裝成 200μl 的小份 ,貯存于 70℃可保存半年。 對照組 2: 以同體積 的無菌雙蒸水代替 DNA 溶液 ,但涂板時(shí)只取 5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB 平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。自 70 14 年代中葉首例 cDNA 克隆問世以來 ,已發(fā)展了許多種提高 cDNA 合成效率的方法 ,并大大改進(jìn)了載體系統(tǒng)，目前 cDNA 合成試劑已商品化。 DEPC 與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物 ,因而使用時(shí)需小心。許多公司有現(xiàn)成的總 RNA 提取試劑盒 ,可快速有效地提取到高質(zhì)量的總 RNA。 MLV反轉(zhuǎn)錄酶只有單個(gè)多肽亞基 ,兼?zhèn)湟蕾囉?RNA 和依賴于 DNA 的 DNA 合成活性 ,但降解 RNA:DNA雜交體中的 RNA 的能力較弱 ,且對熱的穩(wěn)定性較 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶差。但自身引導(dǎo)合成法較難控制反應(yīng)，而且用 S1 核酸酶切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)無一例外地將導(dǎo)致對應(yīng)于 mRNA 539。 四、 cDNA 的分子克隆 已經(jīng)制備好的雙鏈 cDNA 和一般 DNA 一樣 ,可以插入到質(zhì)?；蚴删w中 ,為此 ,首先必需連接上接頭 (Linker),接頭可以是限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)片段 ,也可以利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體和雙鏈 cDNA 的末端接上一段寡聚 dG 和 dC 或 dT 和 dA 尾巴 ,退火后形成重組質(zhì)粒 ,并轉(zhuǎn)化到宿主菌中進(jìn)行擴(kuò)增。 洗脫緩沖液： 10mmol/L Tris 棄去上清液，按每 ml Trizol 液加入至少 1ml 的比例加入 75%乙醇，渦旋混勻， 4℃ 下 7500g離心 5 分鐘。 將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱 中或裝入填有經(jīng) DEPC 處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為 ，用 3 倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。 用少量水溶解 RNA 液，即可用于 cDNA 合成（或保存在 70%乙醇中并貯存于 70℃ ）。 17 四、操作步驟 取一 eppendorf 管加入提純 TMV（ 10mg/ml)400ml，再加入等體積酚 /氯仿，蓋緊管蓋后用手充分振蕩 1 分鐘， 4℃ 下 12020g 離心 10 分鐘。 由 于病毒 RNA 鑲嵌于外殼蛋白里面，因此要充分剝?nèi)ゲ《就鈿さ鞍?，一般需要多次進(jìn)行酚/氯仿的抽提。 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP 混合物 (各 ) 2625μ rRNasinR RNA 酶抑制劑 10,000μ MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶 , RNase H 5μg 對照 RNA 400μl MMLV 第二鏈緩沖液 (10)，配方如下： 400mmol/L Tris 2. 操作步驟 (1) 取一滅菌的無 RNA 酶的 eppendorf 管 ,加入 RNA 模板和適當(dāng)引物 ,每 μg RNA 使用 物 (如使用 NotⅠ 引物接頭 ,使用 ),用 H2 O 調(diào)整體積至 15μl, 70℃ 處理 5 分鐘 ,冷卻至室溫 ,離心使溶液集中在管底 ,再 依次加入 5第一鏈緩沖液 5μl rRNasin RNA 酶抑制劑 25U MMLV(H )反轉(zhuǎn)錄酶 200U H2 O 調(diào)至總體積 25μl (2) 用手指輕彈管壁 ,吸取 5μl至另一 eppendorf 管，加入 25μCi [α32 P] dCTP (400Ci/mmol),用以第一鏈同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y定。 加入 2μ T4 DNA 聚合酶 , 37℃ 溫浴 10 分鐘。 2. 操作步驟 (1) 各取一 2(5)中和二 (4)反應(yīng)液各 3μl,點(diǎn)于玻璃纖維濾紙 ,室溫干燥 , 這些樣品代表總放射性活性。 (3) 用玻璃纖維濾紙過濾 ,用冰冷的 5% TCA 洗三次 ,每次用 5ml TCA,再用 5ml 丙酮或乙醇漂洗 , 這些樣品代表摻入放射性活性。 用等體積酚 :氯仿抽提 cDNA 反應(yīng)液 ,離心 2 分鐘?？扇?90μl進(jìn)行電泳分析 (先用苯酚抽提 ),另 10μl進(jìn)行同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y定。 850mmol/L KCl。該系統(tǒng)的第一鏈合成使用 MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶 ,cDNA 第二鏈合成采用置換合成法 ,采用 RNaseH 和 DNA 聚合酶 Ⅰ 進(jìn)行置換合成 ,最后用 T4 DNA聚合 酶切去單鏈末端 ,方法簡便易行。 吸取水相于新 eppendorf 心管，加入等體積氯仿，用手倒置離 心管數(shù)十秒， 4℃ 下 12020g 離心 10 分鐘。 oligo(dT)纖維素柱用后可用 ，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入%疊氮鈉（ NaN3)冰箱保存，重復(fù)使用。 將（一）中提取的 RNA 液于 65℃ 溫育 5 分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積 2x 柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當(dāng)所有 RNA 溶液進(jìn)入柱床后，加入 1 倍柱床體積的 1x層析柱加樣溶液。然后將 RNA 溶于水中，必要時(shí)可 55℃ 60℃ 水溶 10 分鐘。 四、操作步驟 （一）動(dòng)植物總 RNA 提取 Trizol 法 Trizol 法適用于人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克 。 第二節(jié) 動(dòng)植物組織 mRNA 提取 一、材料 水稻葉片或小鼠肝組織。 (2) 置換合成法 該方法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的 cDNA:mRNA 雜交鏈不用堿變性 ,而是在 dNTP 存在下 ,利用 RNA 酶 H 在雜交鏈的 mRNA 鏈上造成切口和缺口。 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶和 MLV 反 轉(zhuǎn)錄酶利用 RNA 模板合成 cDNA 時(shí)的最適 pH 值 ,最適鹽濃度和最適溫室各不相同 ,所以合成第一鏈時(shí)相應(yīng)調(diào)整條件是非常重要。末端含有多聚 (A)+ 的特點(diǎn) ,當(dāng) RNA 流經(jīng) oligo (dT)纖維素柱時(shí) ,在高鹽緩沖液作用下 ,mRNA 被特異的吸附在 oligo(dT)纖維素上 ,然后逐漸降低鹽濃度洗脫 ,在低鹽溶液或蒸餾水中 ,mRNA 被洗下。但 DEPC 能與胺和巰基反應(yīng) ,因而含 Tris 和 DTT 的試劑不能用 DEPC 處理。 一、 RNA 制備 模板 mRNA 的質(zhì)量直接影響到 cDNA 合成的效率。 轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下： 轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù) 稀釋倍數(shù) 轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積／涂板菌液體積 轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)／每 mg 質(zhì)粒 DNA）＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒 DNA 加入量 (mg) 感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)＝對照組２菌落數(shù) 稀釋倍數(shù)