植物細胞融合實驗ppt課件(完整版)
【正文】 列； 完整煙草原生質體 （ 40 ） 原生質體成串 （ 40 ） 再用 1~5V/cm直流電脈沖 /微秒沖擊細胞或原生質體的粘接點，細胞膜降解造成若干微孔，于是在膜之間形成通道，使細胞質得以交換；最后導致新的球狀細胞的形成。洋蔥約 4h，煙草約3h。然后靜置 10分鐘，使原生質體貼在皿底上，形成一薄層（應有 3~5個平皿的重復）。打破了不同種生物間的生殖隔離限制，大大擴展了可用于雜交的親本組合范圍。然后輕觸脈沖觸發(fā)開關，施加 3次融合脈沖，每次間隔 1s。 4）顯微鏡觀察提純后的原生質體，若雜質較多可重復 1）～ 3）操作。 2）配制 （ 用于懸浮原生質體） 3)PEG液： 30%（ w/v) PEG(MW=6000) kH2PO4 山梨醇 mol/L 調 pH ；用時現(xiàn)配！ 4）電融合液： 甘露醇 pH ~ 1）大型儀器： 高壓滅菌鍋，超凈工作臺，離心機，倒置顯微鏡，電融合儀。通過電泳，兩細胞膜緊密接觸，且膜表面的蛋白質分子分離，產(chǎn)生了無蛋白的類脂區(qū)。 在原生質體細胞膜與膜緊密接觸的部位，膜內(nèi)蛋白質顆粒易位并凝聚。 首先出現(xiàn)細胞凝集現(xiàn)象；然后部分凝集細胞之間的膜發(fā)生粘連；繼而融合形成多核細胞；在培養(yǎng)過程中多核細胞又進行核的融合而成為單核的雜種細胞，而那些不能形成單核的融合細胞在培養(yǎng)過程中逐漸死亡。 二、細胞融合 （ cell fusion)概念 在外力（誘導劑或促融合劑）作用下，兩個或兩個以上的異源細胞或原生質體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質融合和核融合并形成雜種細胞的現(xiàn)象。 PEG是一種多聚化合物。也有解釋為 Ca2+結合到帶負電磷脂的電離基上，使磷脂分子在膜上相互分離，由此引起融合。 電融合法優(yōu)點 （與 PEG法比較） ： 融合率高； 重復性強； 誘導僅發(fā)生在質膜接觸部位，對細胞 或原生質體傷害??； 融合是在同步狀態(tài)下進行，活細胞數(shù)目多； 裝置精巧，方法簡單，可在顯微鏡下觀察或錄像融合過程； 免去 PEG誘導后的洗滌過程，誘導過程可控制性強。 1）酶解后，用 300目銅網(wǎng)過濾酶液，去除未酶解的雜質，將濾液收集在 10ml離心管中。 4）用吸管將等量的 PEG溶液緩慢地加在原生質體液滴上，再靜置 10~15分鐘。 (1) (1) (2) (3) (4) (5) 植物體細胞雜交過程示意圖 Protoplast Fusion HETEROKARYON LOSS OF ONE NUCLEUS NUCLEAR FUSION
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