pcr技術20xx級碩士(完整版)
【正文】 統(tǒng)及相應的分析軟件。 適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列 既往鑒定細胞內特異序列一般采用原位雜交 （ ISH） ,但在每個細胞中目的片段的拷貝數少于 10的情況下 ,該方法的敏感度就明顯下降 。 用途：制備核酸序列測定的模板 制備雜交探針 基因組 DNA結構功能的研究 不對稱 PCR 高濃度引物 低濃度引物 反向 PCR (reverse PCR) 用反向的互補引物來擴增兩引物以外的 DNA片段對某個已知 DNA片段兩側的未知序列進行擴增。 Taq DNA聚合酶（ thermus aquaticus) 酶活性(%) 溫度 (℃ ) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 72℃ 94℃ 55℃ PCR循環(huán) 三、 PCR技術的改進和發(fā)展 ? 1988年第一臺 PCR儀問世， PCR逐步實現自動化 ? 1989年美國 《 Science》 雜志列 PCR為十余項重大科學發(fā)明之首，比喻 1989年為 PCR爆炸年。 引物 引物 Mullis的構思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定 DNA片段 1983年 94℃ 變性 5065℃ 退火 XX℃ 延伸 94℃ 55℃ 37℃ ? 三、 PCR技術的改進和發(fā)展 ? 1988年 Saiki等將耐熱 DNA聚合酶（ Taq）引入了 PCR技術，大大提高了 PCR的效率。分別稱為限制性引物和非限 制性引物 ,其最佳比例一般是 ∶ μ M,關鍵是限制 性引物的絕對量?？蛇M行細胞內定位。 熒光定量 PCR標記方法 ?內摻式染料 SYBR Green I ?序列特異性探針 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) ?引物特異性探針 Amplifluor (Intergen) 5’ 3’ 5’ 3’ SG Excitation SG SG SG SG Emission SYBRGreen I 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG Excitation Emission SYBRGreen I R Q 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Excitation Q Excitation Taqman Probe R Q Excitation Excitation Emission
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