05版藥典微生物限度檢查法操作要點(diǎn)(完整版)
【正文】 ml溫度不超過(guò)45℃的溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。陰性對(duì)照菌不得檢出。驗(yàn)證試驗(yàn)按供試液的制備和控制菌檢查法的規(guī)定及下列要求進(jìn)行。3．離心沉淀集菌法取一定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘(供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取全部上清液再離心) ,棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補(bǔ)至原量。回收率=[(試驗(yàn)組菌數(shù)本底菌組菌數(shù))/菌液組菌數(shù)]當(dāng)大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，枯草桿菌3個(gè)菌株的回收率均達(dá)到70%以上時(shí)，細(xì)菌計(jì)數(shù)用該驗(yàn)證的方法檢驗(yàn)。然后，吸出胞子懸液(用管口帶有薄的無(wú)菌棉花或紗布能過(guò)濾菌絲的無(wú)菌毛細(xì)吸管)至無(wú)菌試管內(nèi)，％無(wú)菌氯化鈉溶液制成每lml含孢子數(shù)50～l00cfu的孢子懸液。由于以前版本的藥典沒(méi)有要求對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行必要的驗(yàn)證，所以大家都覺(jué)得不好理解、不好難操作。菌液的制備：接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48小時(shí)。常規(guī)法做一個(gè)樣品的細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)，需要多少個(gè)平皿呢？試驗(yàn)組：52=10個(gè)，即每個(gè)菌株做2ml共需10個(gè)；菌液組：52=10個(gè)，即每個(gè)菌株的加菌量，每株2個(gè)皿。具體操作：（以1ml分至5個(gè)皿為例）就是取1:10的供試液1ml均勻分注到5個(gè)平皿中，每株試驗(yàn)菌平行制備2ml的平皿數(shù)，然后加入相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)，計(jì)算各菌株的回收率。每種菌株至少制備一張濾膜。當(dāng)采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過(guò)濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過(guò)濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。1．平皿法常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法都是平皿法。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。 (1)當(dāng)僅有1個(gè)稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以該級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。沖洗方法和沖洗量同“計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證”。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的加菌量為l0～l00cfu，方法同供試品的控制菌檢查。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)的菌落與表2所列的菌落形態(tài)特征不符或?yàn)榉歉锾m陰性無(wú)芽孢桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長(zhǎng)的菌落與表2所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌，應(yīng)進(jìn)行確證試驗(yàn)。如試驗(yàn)管不出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)氣、消化碎肉、臭氣等現(xiàn)象，判供試品未檢出梭菌；否則，涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，在厭氧條件下培養(yǎng)48～72小時(shí)。8 / 8。 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) 取上述平板上的菌落，置潔凈玻片上，滴加3％過(guò)氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生，為過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該膽鹽乳糖發(fā)酵管檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。陰性對(duì)照試驗(yàn) 取稀釋液10m1照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對(duì)照。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。油類(lèi)供試品，其濾膜和過(guò)濾器在使用前應(yīng)充分干燥。若比值不大于2，以?xún)?
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