05版藥典微生物限度檢查法操作要點(完整版)
【正文】 ml溫度不超過45℃的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。陰性對照菌不得檢出。驗證試驗按供試液的制備和控制菌檢查法的規(guī)定及下列要求進行。3．離心沉淀集菌法取一定量的供試液，3000轉/分離心20分鐘(供試液如有沉淀，先以500轉/分離心5分鐘，取全部上清液再離心) ,棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補至原量?；厥章?[(試驗組菌數本底菌組菌數)/菌液組菌數]當大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，枯草桿菌3個菌株的回收率均達到70%以上時，細菌計數用該驗證的方法檢驗。然后，吸出胞子懸液(用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管)至無菌試管內，％無菌氯化鈉溶液制成每lml含孢子數50～l00cfu的孢子懸液。由于以前版本的藥典沒有要求對檢驗方法進行必要的驗證，所以大家都覺得不好理解、不好難操作。菌液的制備：接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48小時。常規(guī)法做一個樣品的細菌、霉菌和酵母菌計數驗證試驗，需要多少個平皿呢？試驗組：52=10個，即每個菌株做2ml共需10個；菌液組：52=10個，即每個菌株的加菌量，每株2個皿。具體操作：（以1ml分至5個皿為例）就是取1:10的供試液1ml均勻分注到5個平皿中，每株試驗菌平行制備2ml的平皿數，然后加入相應的瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)，計算各菌株的回收率。每種菌株至少制備一張濾膜。當采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。1．平皿法常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法都是平皿法。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數。 (1)當僅有1個稀釋級的菌落數符合上述規(guī)定，以該級的平均菌落數乘以稀釋倍數的值報告菌數。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。沖洗方法和沖洗量同“計數方法的驗證”。陽性對照試驗的加菌量為l0～l00cfu，方法同供試品的控制菌檢查。若平板上無菌落生長，或生長的菌落與表2所列的菌落形態(tài)特征不符或為非革蘭陰性無芽孢桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長的菌落與表2所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭陰性無芽孢桿菌，應進行確證試驗。如試驗管不出現渾濁、產氣、消化碎肉、臭氣等現象，判供試品未檢出梭菌；否則，涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，在厭氧條件下培養(yǎng)48～72小時。8 / 8。 過氧化氫酶試驗 取上述平板上的菌落，置潔凈玻片上，滴加3％過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產生，為過氧化氫酶試驗陽性，否則為陰性。若產酸產氣，判該膽鹽乳糖發(fā)酵管檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。陰性對照試驗 取稀釋液10m1照相應控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥。若比值不大于2，以兩
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