w03細(xì)胞生物學(xué)研究方法(完整版)
【正文】 干擾 ， 所以其分辨率比普通熒光顯微鏡提高 ~倍 ， 還可以 “ 光學(xué)切片 ” 方式觀察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu) 。 （ 2） 誘發(fā)熒光 —— 在細(xì)胞中加入某種不會(huì)使細(xì)胞化學(xué)組分變性的熒光染料 （ 熒光素 ） ， 與細(xì)胞內(nèi)某種特定成分結(jié)合在一起 ， 經(jīng)紫外光照射激發(fā)出熒光 。 ? ∵ 顯微鏡的分辨力是有一定的極限 ， ? ∴ 其放大率受分辨力制約而不可能無限提高 ， 普通光鏡放大率的經(jīng)驗(yàn)界值：有效放大倍數(shù)極限 =物鏡鏡口率 1000。 圖 21 尼康 E600 顯微鏡 ? 人肉眼分辨力測(cè)試是規(guī)定在明視距離25cm所分辨的最短間距來表示 ， 正常人肉眼分辨力的極限值是 (毫米 )， 顯微鏡的分辨力可按下列公式來計(jì)算 R=（ R 是分辨距離 ， ， λ是 照明光波波長(zhǎng) ， N〃A 是顯微鏡物鏡的鏡口率 —— 光學(xué)性能指標(biāo) ， 每個(gè)物鏡上都標(biāo)有其鏡口率的數(shù)值 ） 。 圖 28 相差顯微鏡照明原理 ? 當(dāng)光線穿過無色透明且非勻質(zhì)的被檢物體 （ 例如活細(xì)胞 ） 其波長(zhǎng)和振幅都無明顯變化 ， 僅光相位出現(xiàn)了一定程度變化 ， 此時(shí)觀察感覺反差小 ， 物體內(nèi)部結(jié)構(gòu)難分辨 ， 這就是普通光鏡不適宜用于觀察活細(xì)胞的原因 ， 相差顯微鏡卻是運(yùn)用一些特殊裝臵 ， 使通過被檢物體的光線分離成兩組光波 ，并人為地使這兩組光波之間微弱的相位差加大 ， 再經(jīng)過光波干涉作用 ， 使看不見的相位差轉(zhuǎn)變成可見的振幅差 ， 從而反差增強(qiáng) ， 使能夠清晰看到被檢物體及其內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu) ， 所以相差顯微鏡下的樣品不需染色 ， 可清晰觀察活細(xì)胞及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化 。 ? ? 熒光顯微鏡目前在分子細(xì)胞生物學(xué)研究中應(yīng)用十分廣泛，以熒光素標(biāo)記各種探針進(jìn)行基因定位分析和對(duì)某些特異蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定位檢測(cè)分析，靈敏清晰，在熒光顯微鏡下對(duì)樣品可同時(shí)采用兩種以上（有的多達(dá) 6~12種）熒光探針檢測(cè)，依據(jù)其不同顏色的熒光信號(hào)，我們能一次判斷識(shí)別多個(gè)基因位點(diǎn)，因此這是非常實(shí)用的研究技術(shù)，此外，由于在熒光標(biāo)記檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，易發(fā)生一些非檢測(cè)目標(biāo)出現(xiàn)假象的“背景噪音”問題，因而現(xiàn)可在熒光顯微鏡設(shè)備上安裝一套“數(shù)字成像處理系統(tǒng) CCD” ，即把圖像信息通過攝像機(jī)和電腦的圖象數(shù)字化處理，使信號(hào)反差可以放大增強(qiáng)，對(duì)假象削弱 or削除從而明顯提高檢測(cè)的精確率和靈敏度。因?yàn)楦咚龠\(yùn)動(dòng)的電子流如果與空氣中的微粒和分子碰撞就會(huì)改變它的發(fā)射方向，導(dǎo)致成像模糊，故要求電鏡內(nèi)的工作系統(tǒng)（包括樣品室）都必須保持高度真空狀態(tài)，并且樣品都必須脫水（真空中水易蒸發(fā) or升華，電子流與水分子相碰，改變其方向，使成像模糊）因此說透鏡電鏡不能用來觀察活的樣品； ? （ 5）樣品厚度必須 900（即 90nm,） 這是因?yàn)殡娮哟┩改芰τ邢?，樣品過厚則成像不清晰，并且高速穿透的電子會(huì)產(chǎn)生熱量，將原樣品燒出白斑，所以透鏡電鏡觀察的樣品須超薄切片（ 400~500）不能用普通電鏡下的組織切片（ 2~7um）； ? （ 6） 標(biāo)本染色技術(shù)不同，電鏡標(biāo)本染色并不像光鏡標(biāo)本染色上各種顏色，而是使觀察的結(jié)構(gòu)與背景之間，黑白對(duì)比分明，反差強(qiáng)。 ? 缺點(diǎn)： ? （ 1） 分辨力不太高 ， 僅 3~10nm ? （ 2） 不能觀察樣品內(nèi)部 。 ? 當(dāng)不存在抗原時(shí) ， 但隨機(jī)出現(xiàn)了沉積 （ 無論是否抗體與抗原結(jié)合 ， 熒光素都會(huì)沉積 ， 酶也與底物反應(yīng) ）故采用洗脫來避免此現(xiàn)象 。 （ 五 ） 超速離心技術(shù) ultracentrifugation ? 是細(xì)胞生化分析研究的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方法 ， 是分離純化細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)和生物大分子的重要技術(shù)手段 ， 超離心可達(dá)幾萬 —— 幾十萬轉(zhuǎn) /分 （ g） 的高轉(zhuǎn)速 ， 各種細(xì)胞亞微顆粒在離心場(chǎng)中的沉降速率不一樣 ， 衡量各種物質(zhì)顆粒在單位強(qiáng)度離心場(chǎng)中沉降速率的量度 ， 稱為沉降系數(shù) 。 ? （二）細(xì)胞電泳 cell electropboresis ? 細(xì)胞表面的分子具有電荷基團(tuán) ， 因此在外加電場(chǎng)作用下 ， 懸液中的細(xì)胞都會(huì)朝正極泳動(dòng)這稱為細(xì)胞電泳 ， 不同類型的細(xì)胞 or 處于不同生理狀態(tài)下的同種細(xì)胞 ， 由于其細(xì)胞表面的電荷是有所不同 ， 所以在同電場(chǎng)中的電泳對(duì)研究細(xì)胞癌變有重要作用 ， 此外 ， 細(xì)胞電泳裝臵還能用來分離不同種類的活細(xì)胞 。 細(xì)胞培養(yǎng)方式： 液體懸浮培養(yǎng) ， 平板培養(yǎng) ， 回轉(zhuǎn)玻璃管培養(yǎng) 。于是英國(guó)人 Kohler 和 Milstein 1975 將兩種細(xì)胞雜交，產(chǎn)生了能無限繁殖并能分泌抗體的雜交細(xì)胞而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，獲 1984 年諾貝爾獎(jiǎng)。 （ 四 ） 細(xì)胞拆合 : ? 用某些物理方法 （ 例如核移植 ， 去核 ） or 化學(xué)方法 （ 例如以細(xì)胞松馳素 B處理后離心去核 ） 把細(xì)胞拆開為兩部分 —— 核體 （ karyoplast） 和胞質(zhì)體（ cytoplast） ， 再將來自不同種類細(xì)胞的這兩部分組合成 “ 重組細(xì)胞 ” ， 適用于基礎(chǔ)細(xì)胞研究和應(yīng)用基礎(chǔ)研究 ? 習(xí)題 ： ? 一 . 名詞解釋： ? ? ? ? 二 . 簡(jiǎn)答題 : ? 、掃描電鏡、 掃描隧道顯微鏡的原理 ? ? ? ? ? ? 的原理 。 ? 顯微操作技術(shù)器的主體部分是光學(xué)顯微鏡加上顯微 操縱儀組成 ， 顯微操縱儀是能精密調(diào)節(jié)的微動(dòng)機(jī)械裝臵 ，可以在光鏡視野下控制微型解剖針 ， 微電極以及毛細(xì)吸管等器械
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