限制性內(nèi)切酶酶切的常見問題及解決方法(完整版)
【正文】 液中加入 底物 DNA（通常為 λDNA ），調(diào)節(jié)溫度至最適反應(yīng)溫度，溫育 60分鐘。 大多數(shù)星號活性是可以控制的，做酶切反應(yīng)時一般不考慮這方面的因素。這樣可以避免過度消化以及過高的甘油濃度。當(dāng)然，我們大多數(shù)戰(zhàn)友，包括我 自己，考慮最多的是 “ 堿基個數(shù) ” ，對 “ 堿基組成 ” 的考慮通常是采用隨機(jī)，或兼顧引物 Tm及 GC％上。當(dāng)最終反應(yīng)液中甘油濃度大于 12％時，某些限制酶的識別特異性降低，從而產(chǎn)生星活性，更高濃度的甘油會抑制酶活 性。 7. 當(dāng)要用兩種或兩種以上限制酶切割 DNA時，如果這些酶可以在同種緩沖液中作用良好，則兩種酶可同時切割，如果這些酶所要求的緩沖液有所不同，則可采用以下兩種替代方法： ① 先用在低離子強(qiáng)度的緩沖液中活性高的酶切割 DNA，然后加入適量 NaCl及第二種酶，繼續(xù)反應(yīng)； ② 使用能夠 使多數(shù)內(nèi)切酶均表現(xiàn)較高活性的單種緩沖液。 37℃ 或需長時間保溫時，可加入礦物油覆蓋在反應(yīng)液上以減少水分蒸發(fā)。 問題 原因 解決辦法 DNA完全沒有被內(nèi)切酶切割 1) 內(nèi)切酶失活 標(biāo)準(zhǔn)底物檢測酶活性 2) DNA不純，含有 SDS，酚， EDTA等內(nèi)切酶抑制因子 將 DNA過柱純化，乙醇沉淀 DNA 3) 條件不適（試劑、溫度） 檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳 4) DNA酶切位點上的堿基被甲基化 換用對 DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化至 dcm， dam基因型的細(xì)菌菌株 5) DNA酶 切位點上沒有甲基化（如 Dpn I） 換用不同切割非甲基化位點的同裂酶消化 DNA（如 San3A I代替 Dpn I)，重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至 dcm+ dam+菌株中擴(kuò)增 6) DNA位點上存在其它修飾 將 DNA底物與 λDAN 混勻進(jìn)行切割驗證 7) DNA不存在該酶識別順序 換用其它的酶切割 DNA或過量酶消化進(jìn)行驗證 DNA切割不完全 1) 內(nèi)切酶活性下降 用 510 倍量過量消化 2) 內(nèi)切酶稀釋不正確 用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶 3) DNA不純，反應(yīng)條件不佳 同上 4) 內(nèi)切酶識別的 DNA位點上的堿基被 甲基化或存在其它修飾 同上 5) 部分 DNA溶液粘在管壁上 反應(yīng)前離心數(shù)秒 6) 內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準(zhǔn) 將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積 7) 酶切后 DNA粘末端退火 電泳前將樣品置 65℃ 保溫 510分鐘，取出后置冰浴驟冷 8) 由于反應(yīng)溶液、溫度、強(qiáng)烈振蕩使內(nèi)切酶變性 使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液及溫度，避免強(qiáng)烈振蕩 9) 過度稀釋使酶活性降低 適當(dāng)稀釋酶液，反應(yīng)液稀釋的酶不能貯藏 10)反應(yīng)條件不適 使用最佳反應(yīng)體系 11)識別位點兩側(cè)插入了可影響酶切效率的核酸順序 加大酶量 510倍 DNA片段 數(shù)目多于理倫值 1) 內(nèi)切酶星狀活性 檢查反應(yīng)條件：甘油濃度大于 12%，鹽度過低， Mn2+的存在及酶： DNA值過大均均可導(dǎo)致星狀活性，降低酶的用量 2) 其它內(nèi)切酶污染 用 λDNA 作底物檢查酶切結(jié)果 3) 底物中含其它 DNA雜質(zhì) 電泳檢查 DNA，換用其它酶切，純化 DNA片段 酶切后沒有觀察到 DNA片段的存在 1) DNA定量錯誤（如 RNA含量較高） 用 RNA酶 A（無 DNA酶） 100ug/ml 消化 DNA樣，酚抽提后沉淀溶解，定量 2) 在酶切反應(yīng)液中形成非特異的沉淀 在反應(yīng)前透析 DNA樣品或用酒精沉淀 二次 內(nèi)切酶保存期內(nèi)快速失活 1) 保存溫度不合適 內(nèi)切酶貯藏在含 50%甘油的貯藏液中，應(yīng)在 20℃ 低溫保存 2) 以稀釋形式保存 稀釋酶液不宜長期存放，應(yīng)一次使用 3) 貯藏緩沖液不適當(dāng) 使用廠家推薦的貯藏緩沖液 4) 低蛋白濃度 內(nèi)切酶與 500ug/ml的 BSA一起保存 電泳后 DNA片段的帶型彌散，不均一 1) DNA上結(jié)合有蛋白質(zhì) 電泳前上樣液 65℃ 加熱 5min，并加入 %的 SDS，酚 /氯仿抽提純化 2) 內(nèi)切酶中含有 DNA外切酶 減少酶用量或消化時間，換用新包裝的酶 酶切后的 DNA片段連接效率低 1) 含磷酸鹽的濃度高 透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽 2) 內(nèi)切酶失活不全或含有 ATP酶 延長滅活時間或用酚抽提，乙醇沉淀回收 DNA 3) 平末端連接 加大 T4 DNA Ligase用量 4) 外切酶污染 減少酶用量，縮短保溫時
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