【正文】 的試管，保持實驗臺面和實驗柜內(nèi)的整潔。 ⑺ 配制和使用洗液必須極為小心，強(qiáng)酸強(qiáng)堿必須倒入廢液缶或沖稀后排放。 實驗室規(guī)則 ⑴ 實驗前必須認(rèn)真預(yù)習(xí)實驗內(nèi)容，明確本次實驗的目的和要求，掌握實驗原理，寫好實驗預(yù)習(xí)報告，否則，不能進(jìn)行實驗。 1989 年，美國科學(xué)家 Altman 和 Cech 由于發(fā)現(xiàn)某些 RNA 具有酶的功能（稱為核酶）而共享諾貝爾化學(xué)獎。 英國生物化學(xué)家 Sanger 還于 1953 年確定了牛胰島素中氨基酸的精確順序而獲得 1958 年的諾貝爾化學(xué)獎。他們 3 人在 DNA 重組和 RNA 結(jié)構(gòu)研究方面都作出了杰出的貢獻(xiàn)。 1962 年，美國科學(xué)家 Watson 和英國科學(xué)家 Crick 因為在 1953 年提出的 DNA 分子反向平行雙螺旋模型而與英國科學(xué)家 Wilkins 分享了當(dāng)年的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎，后者通過對 DNA 分子的 X射線衍射研究證實了 Watson 和 Crick 的 DNA模型，他們的研究成果開創(chuàng)了生物科學(xué)的歷史新紀(jì)元。 30 年代 ： 電子顯微鏡技術(shù)打開了微觀世界，使我們能夠看到細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和生物大分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。 同學(xué)們通過生物化學(xué)實 驗應(yīng)該做到： ⑴ 學(xué)習(xí)設(shè)計一個實驗的基本思路，掌握各個實驗的基本原理，學(xué)會嚴(yán)密地組織自己的實驗，合理地安排實驗步驟和時間。 １ 〔Ⅰ〕 理論部分 1. 緒論 歡迎同學(xué)們到生物化學(xué)實驗室來！對于大多數(shù)學(xué)生來說，這不是第一次做化學(xué)實驗，但是我們相信，生物化學(xué)實驗一定是大家最感興趣、最激動人心的實驗，當(dāng)然也是花費(fèi)最大、最辛苦的實驗。 ⑵ 訓(xùn)練實驗的動手能力，學(xué)會熟練地使用各種生物化學(xué)實驗儀器，包括各種天平、各種分光光度計、各種離心機(jī)、自動部分收集器、恒流泵、核酸蛋白檢測儀、冰凍干燥機(jī)、酸度計、電導(dǎo)率儀、高速分散器、各種電泳裝置和搖床等等。 40 年代 ： 層析技術(shù)大發(fā)展，兩位英國科學(xué)家 Martin 和 Synge 發(fā)明了分配色譜（層析），他們獲得了 1952 年的諾貝爾化學(xué)獎。在 X射線衍射技術(shù)方面，英國物理學(xué)家 Perutz 對血紅蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行 X射線結(jié)構(gòu)分析 , Kendrew 測定了肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)，成為研究生物大分子空間立體結(jié)構(gòu)的先驅(qū)，他們同獲 1962年諾貝爾化學(xué)獎。 1981 年由 Jenson 和 Lukacs 首先提出的高效毛細(xì)管電泳技術(shù)（ HPCE） ，由于其高效、快速、經(jīng)濟(jì)，尤其適用于生物大分子的分析，因此受到生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和化學(xué)等學(xué)科的科學(xué)工作者的極大重視，發(fā)展極為迅速，是生化實驗技 ３ 術(shù)和儀器分析領(lǐng)域的重大突破，意義深遠(yuǎn)。 1959年，美藉西班牙裔科學(xué)家 Uchoa發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了將基因內(nèi)的遺傳信息通過 RNA中間體翻譯成蛋白質(zhì)的過程。 1993 年，美國科學(xué)家 Roberts 和 Sharp 由于在斷裂基因方面的工作而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。 ⑵ 實驗時自覺遵守實驗室紀(jì)律，保持室內(nèi)安靜，不大聲說笑和喧嘩。電泳后的凝膠和各種廢物不得倒入水池，只能倒入廢物桶。 ⑾ 每組的儀器和玻璃器皿要用油漆編號，嚴(yán)禁抄拿 他組儀器，不得將器皿遺棄在分光光度計內(nèi)和其他實驗臺面上，打破了玻璃儀器要及時向教師報告，并自覺登記，學(xué)期結(jié)束時按規(guī)定進(jìn)行處理。 ※※ 自燃點：液體蒸汽在空氣中自燃時的溫度。 滅火方法： 實驗室中一旦發(fā)生火災(zāi)切不可驚慌失措，要保持鎮(zhèn)靜，根據(jù)具體情況正確地進(jìn)行滅火或立即報火警（火警電話 119）。生物化學(xué)實驗室常用的易燃物蒸汽在空氣中的爆炸極限（體積％）見 表 1— 2。 劇毒物有：氰化物、砷化物 、乙腈 、甲醇、氯化氫、汞及其化合物等。③ 砷和汞中毒者應(yīng)立即送醫(yī)院急救。 ⑶割傷： 這是生物化 學(xué)實驗室常見的傷害，要特別注意予防，尤其是在向橡皮塞中插入溫度計、玻璃管時一定要用水或甘油潤滑，用布包住玻璃管輕輕旋入，切不可用力過猛，若發(fā)生嚴(yán)重割傷時要立即包扎止血，就醫(yī)時務(wù)必檢查傷部神經(jīng)是否被切斷。⑤儀器使用前要先檢查外殼是否帶電。 實驗記錄與實驗報告 實驗記錄 詳細(xì)、準(zhǔn)確、如實地作好實驗記錄是極為重要的，記錄如果有誤，會使整個實驗失敗，這也是培養(yǎng)學(xué)生實驗?zāi)芰蛧?yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)作風(fēng)的一個重要方面。 ⑷ 實驗中要記錄的各種數(shù)據(jù)，都應(yīng)事先在記錄本上設(shè)計好各種記錄格式和表格，以免實驗中由于忙亂而遺漏測量和記 錄，造成不可挽回的損失。實驗報告必須獨立完成，嚴(yán)禁抄襲。有時也可用兩端有小橫線的垂直線段來表示實驗點，其線段的長度與實驗誤差相符。②生物化學(xué)實驗對許多常見的污染雜質(zhì)十分敏感，如金屬離子（鈣、鎂離子等）、去污劑和有機(jī)物殘基等，因此玻璃儀器（包括離心管等塑料器皿）是否徹底清洗凈就是非常重要的。 洗液的配制 因己確定鉻有致癌作用，因此 配制和使用洗液時要極為小心，常用兩種配制方法如下： ⑴ 取 100mL 工業(yè)濃硫酸置于燒杯內(nèi)，小心加熱，然后慢慢加入 5g 重鉻酸鉀粉末，邊加邊攪拌，待全部溶解并緩慢冷卻后，貯存在磨口玻璃塞的細(xì)口瓶內(nèi)。 ⑹ 尿素洗滌液：為蛋白質(zhì)的良好溶劑，適用于洗滌盛過蛋白質(zhì)制劑及血樣的容器。 ⑴ 滴管（圖 1－ 1 中 (E)） 使用方便，可用于半定量移液，其移液量為 1mL— 5mL，常用 2mL，可換不同大小的滴頭（圖 1－ 1 中 (A)）。 １１ 圖 1－ 1 生化實驗中常用的移液器具 圖 1－ 1 (H)為血清吸管，其刻度一直刻到管端出口處，由于沒有管尖，不會殘留液體 ，但需在液體流完后仃留 15～20 秒，常用于吸取血清等粘度大的液體。 2) 10?L～ 100?L 有存液微量進(jìn)樣器： 不銹鋼的針尖管部分是空管，進(jìn)樣器的柱塞不能到達(dá)，因而管內(nèi)會存有空氣或液體，其使用注意事項是：① 不可吸取濃堿溶液，以免腐蝕玻璃和不銹鋼零件。 (％～ ％ )，移液的精密度（即重復(fù)性誤差）更小些，為 ≤ ％。 １３ 圖 1－ 2 自動取液器示 意圖 緩沖溶液與 pH 測定 緩沖溶液是一類能夠抵制外界加入少量酸和堿的影響，仍能維持 pH 值基本不變的溶液。 1923 年由丹麥化學(xué)家 和英國化學(xué)家 同時提出了酸堿質(zhì)子學(xué)說，發(fā)展了酸堿理論，被后人稱為酸堿質(zhì)子理論或 Br246。該方程表示了溶液 pH 與溶質(zhì)中可解離基團(tuán) pKa 之間的關(guān)系。 用鉀鹽比鈉鹽好，因為低溫時鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時，只能用磷酸 １６鈉而不能用磷酸鉀，因為 SDS（十二烷基硫酸鈉）會與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸鉀。 ③易吸收空氣中的 CO2，所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封。 ⑸ 氨基酸緩沖液 此緩沖液使用的范圍寬，可用于 pH=～ ，例如最常用的有： 甘氨酸 — HCl 緩沖液： pH=～ ， 甘氨酸 — NaOH 緩沖液： pH=～ ， 甘氨酸 — Tris 緩沖液： pH=～ ，（此緩沖液用于廣泛使用的 SDS— 聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液）， 組氨酸緩沖液： pH=～ ， 甘氨酰胺（ glycine amide）緩沖液： pH=～ ， 甘氨酰甘氨酸（ glycylglycine）緩沖液： pH=～ 。 pH 值的測定 測定溶液 pH 值通常有兩種 方法，最簡便但較粗略的方法是用 pH 試紙，分為廣泛和精密 pH 試紙兩種。過去是使用兩個電極，即玻璃電極和參比電極（甘汞或銀 — 氯化銀電極），現(xiàn)在它們已淘汰，被兩種電極合一的復(fù)合電極所代替。 (A) 玻璃電極 (B) 復(fù)合電極 (C) 參比電極（銀－氯化銀電極） 圖 1－ 3 pH 電極示意圖 測定 pH 值時，玻璃電極和參比電極同時浸入溶液中，構(gòu)成一個“全電池”，如下圖所示： pH 計 １９ Ag/AgCl HCl( ) 樣品 4mol/L KCl 或 Ag/AgCl 或 溶液 飽和 KCl Hg/HgCl 玻璃電極 參比電極 使用時應(yīng)注意： ⑴經(jīng)常檢查電極內(nèi)的 4mol/L KCl 溶液的液面，如液面過低則應(yīng)補(bǔ)充 4mol/L KCl 溶液。 ⑹電極的玻璃泡容易被污染。生化實驗中經(jīng)常配制比使用濃度高十倍的“貯液”，使用時再稀釋到所需濃度，由于濃度變化很大，溶液 pH 會 有變化，因而稀釋后仍需對其 pH 進(jìn)行調(diào)整。生化實驗對所用水的純度是要求比較高的，通常可以認(rèn)為，水的質(zhì)量越高，實驗的結(jié)果就越真實可靠和準(zhǔn)確，為此必須保證實驗用水的質(zhì)量。不含金屬離子的水，需用亞沸蒸餾水，即用石英亞沸蒸餾器進(jìn)行蒸餾，其特點是在液面上方加熱，但水并不沸騰，只是液面處于亞沸狀 態(tài)，可將水蒸氣帶出的雜質(zhì)減至最低，但制水量較小，每小時約 1～ 4 升。 ⑵ 液體體積度量系統(tǒng)：常用的有各種量筒、移液管、容量并、微量進(jìn)樣器和各種自動取液器等。 層析裝置 層析又稱為色譜，是分離各種生物大分子的主要手段之一，因而各種層析系統(tǒng)和核酸蛋白檢測器就是生化實驗室最常用的儀器設(shè)備。該反應(yīng)是 用 DNA 聚合酶在體外大量擴(kuò)增 DNA 片段的一種方法。 ⑸廢物處理器：使用同位素應(yīng)有能夠安全地存放和處理同位素廢物的場所，否則嚴(yán)禁使用同位素。 基因?qū)雰x 用于向 受體生物細(xì)胞中導(dǎo)入基因。 ⑶組織打碎機(jī)和勻漿器：用于各種生物材料、動植物組織和細(xì)胞的破碎。 由上述內(nèi)容可見，生化實驗室所需裝備的各種儀器設(shè)備和設(shè)施是多種多樣的，因而要求每一位生物化學(xué)工作者和學(xué)生都必須非常重視這些儀器設(shè)備和設(shè)施的使用和維護(hù)，必須具有較強(qiáng)的實驗動手能力。 ⑵許多生物大分子在生物材料中的含量極微，只有萬分之一、幾十萬分之一，甚至幾百萬分之一。②建立相應(yīng)的可靠的分析測定方法，這是制備生物大分子的關(guān)鍵，因為它是整個分離純化過程的“眼睛”。④生物材料的破碎和預(yù)處理。例如由腦垂體組織取得某些激素的釋放因子，要用幾噸甚至幾十噸的生物材料，才能提取出幾毫克的樣品。 2. 生物大分子的制備 概述 生物大分子主要是指蛋白質(zhì)、酶（也是一種蛋白質(zhì)）和核酸，這三類物質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)。 ⑸制冰機(jī)：為實驗室提供足夠的碎冰塊。 高效液相色譜儀和毛細(xì)管電泳儀 用于各種生物大分子的分析與鑒定。生物材料的培養(yǎng)有微生物培養(yǎng)、植物細(xì)胞及組織培養(yǎng)、動物細(xì)胞及動物培養(yǎng)等。 ２２ 同位素實驗設(shè)施 生物化學(xué)許多實驗都要用到放射性同位素，如：生物體分子示蹤、分子雜交、放射性檢測等，因此實驗室必須有安全的同位素實驗設(shè)施。 光密度儀 激光光密度儀是適用于多種電泳結(jié)果分析的儀器。 ⑷ 液體溶質(zhì)定量系統(tǒng)：此系統(tǒng)主要是根據(jù)液體溶質(zhì)的某些理化特性而設(shè)計的，不同的物質(zhì)在一定的條件下有特定的吸收光譜，其吸收值的大小與其在溶液中的濃度有一定的關(guān)系，可以通 過測定某物質(zhì)在溶液中的吸收光譜來計算出該物質(zhì)的濃度，因而分光光度計就是生化實驗室必備的儀器分析手段。 所有的各種純水，在貯存中都會被污染：塑料容器會產(chǎn)生有紫外吸收的有機(jī)物；玻璃和金屬容器會產(chǎn)生金屬離子的污染；長時間放置更會使水長菌，空氣中的二氧化碳會溶入水中，所以貯存高純水一定要隔絕空氣，密封蓋嚴(yán)，必要時貯存 在冰箱的冷藏室中。在超純分析和特殊 的生化實驗中要求更高的水質(zhì)，如 15～ 18 MΩ cm 高純無離子水、無熱源高純水、無菌水、亞沸蒸餾水、無二氧化碳蒸餾水等。 生化實驗室的基本設(shè)施與裝備 溫度與環(huán)境設(shè)施 ２０ 許多生化實驗都要求在一定的溫度和濕度下進(jìn)行操作，因此，一個正規(guī)的生化實驗室必須能夠保持恒溫、恒濕的環(huán)境。若被油脂污染，可用丙酮浸泡。 ⑶復(fù)合電極長期不用