【正文】 .................................................................................................................. 23 第 3 章 CPIRF 體外生物學(xué)活性分析 ................................................................ 24 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? .......................................................................................................... 24 實(shí)驗(yàn)方案 .......................................................................................................... 24 試驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備 .......................................................................... 24 目 錄 V 基本實(shí)驗(yàn)方法 .................................................................................................. 26 分析 .................................................................................................................. 30 結(jié)果 .................................................................................................................. 30 小結(jié) .................................................................................................................. 34 第 4 章 結(jié)論 ............................................................................................................... 35 CPIRF 制備條件優(yōu)化 ...................................................................................... 35 CPIRF 主要成分分析 ...................................................................................... 35 CPIRF 體外生物學(xué)活性分析 .......................................................................... 35 致 謝 ............................................................................................................................. 36 參考文獻(xiàn) ........................................................................................................................ 37 附 錄 ............................................................................................................................. 40 攻讀學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文及參加科研情況 .................................................. 45 圖表目錄 VI 圖 表 目 錄 圖目錄 圖 1 1 正交試驗(yàn)直觀分析 ........................................................................................... 12 圖 1 2 正交試驗(yàn)四因素效應(yīng)曲線圖 ........................................................................... 12 圖 1 3 正交試驗(yàn)四因素分析 圖 ................................................................................... 13 圖 1 4 CPIRF 紫外特征峰檢測(cè) ................................................................................... 13 圖 2 1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線 ................................................................................... 19 圖 2 2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 ............................................................................................... 21 圖 2 3 總核酸磷標(biāo)準(zhǔn)曲線 ........................................................................................... 22 圖 2 4 無機(jī)磷核酸磷標(biāo)準(zhǔn)曲線 ................................................................................... 22 圖 3 1 Ea 玫瑰花環(huán)對(duì)照?qǐng)D（左：陽 性；右：陰性） ............................................. 30 圖 3 2 透析法 CPIRF 鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率 .............................................................. 31 圖 3 3 超濾法 CPIRF 鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率 .............................................................. 32 圖 3 4 超濾法與透析法鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率比較 ................................................... 32 圖 3 5 超濾法與透析法抑瘤率（ Hela）比較圖 ....................................................... 33 圖 3 6 超濾法與透析法抑瘤率 （ CX1） 比較圖 ...................................................... 33 表目錄 表 1 1 試驗(yàn)材料 ............................................................................................................. 8 表 1 2 試驗(yàn)所用試劑一覽表 ......................................................................................... 8 表 1 3 主要儀器設(shè)備 ..................................................................................................... 8 表 1 4 正交設(shè)計(jì)水平因素表 ....................................................................................... 10 表 1 5 正交水平分布表 ............................................................................................... 10 表 1 6 正交試驗(yàn)多肽含量（ n=3， x177。這一類生命基礎(chǔ)物質(zhì)制得的藥物具有針對(duì)性強(qiáng)，毒副作用低，易為人體所吸收等特點(diǎn)，日漸受到各國醫(yī)藥界的關(guān)注。然而人胎盤來源短缺且由于倫理 、 法律等的限制，因此，現(xiàn)多以動(dòng)物胎盤（牛胎、豬胎、羊胎、鹿胎）替代。 人胎盤成分 胎盤可分泌多種激素、酶類，含有多種蛋白質(zhì)、抗體、磷脂、生長因子、細(xì)胞因子及能刺激抗體免疫系統(tǒng)的小分子活性物質(zhì) [4]。正常分娩胎盤中含多種重要化學(xué)元素和微量元素微生物 B1乙酰膽堿等，含有鈣、鐵、鎂、鋅、硒等。無論在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床實(shí)驗(yàn)上都已證實(shí)，胎盤對(duì)抗衰老組織有明顯的復(fù)活作用，在臨床上對(duì)受創(chuàng)的組織及潰瘍的治療也有明顯的效果。趙麗娟等 研究表明，在化療中輔以胎盤提取物，不僅可以增強(qiáng)機(jī)體抵抗毒性反應(yīng)的能力，且能夠促進(jìn)組織的修復(fù) [18]。透析法和超濾法都屬于生化制藥工藝中的膜分離技術(shù)，膜分離的原理主要是利用溶液中溶質(zhì)分子的大小、形狀、性質(zhì)等差別對(duì)各種膜技術(shù)表現(xiàn)出來不同的可透性而達(dá)到引 言 4 分離目的 [22]。 牛、豬、羊胎盤 李魯龍等 對(duì)牛胎盤營養(yǎng)成分分析結(jié)果表明，牛胎盤粉中含有的必須氨基酸含量是奶粉的 3 倍，牛胎盤具有較高的生物效應(yīng)，是一種無毒安全、無副作用的營養(yǎng)品，還是一種高蛋白、高營養(yǎng)的保 健品 [30]。寧鵬 等研究表明，牦牛胎盤可以通過增強(qiáng)某些組織中 TSOD 的活性，降低 MAD 的含量，從而起到抗氧化的作用 [38]?，F(xiàn)代研究表明 , 鹿胎盤含有蛋白質(zhì)（免疫球蛋白、尿激酶、溶菌酶）、多肽（如鹿胎免疫調(diào)節(jié)因子等多種因子）、促性腺激素、催乳素、多糖、多種礦物元素、氨基酸和維生素等。研究表明，鹿胎及胎盤制劑對(duì) 老年雄性大鼠免疫器官發(fā)育有一定的促進(jìn)作用，雖沒有達(dá)到顯著水平，但可顯著提高血清球蛋白質(zhì)量，說明胎盤制劑對(duì)老年雄性大鼠的體液免疫功能具有一定的促進(jìn)作用 [47]。 本研究 有利于開發(fā)高 附加值功能食品和藥品。鹿胎免疫調(diào)節(jié)因子以多肽為主，因此，鹿胎提取液的多肽含量作為正交試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)室具有超濾設(shè)備和透析袋，具有試驗(yàn)可行性。 多肽含量結(jié)果見 表 16。正交試驗(yàn)重復(fù) 3 次，多肽含量平均值見表 16。 4 177。 第 1 章 CPIRF 制備條件優(yōu)化 12 圖 1 1 正交試驗(yàn) 直觀分析 圖 1 2 正交試驗(yàn)四因素效應(yīng)曲線圖 提取液多肽含量 第 1 章 CPIRF 制備條件優(yōu)化 13 圖 1 3 正交 試驗(yàn) 四因素分析圖 以 四因素多肽含量的均值 (R1, R2, R3) 為縱坐標(biāo)，四因素為橫坐標(biāo)做圖，結(jié)果見圖 13。 小結(jié) 研究表明，胎盤免疫調(diào)節(jié)因子或胎盤因子、胎盤免疫調(diào)節(jié)肽或胎盤肽，是通過透析或超濾從胎盤中提取的具有免疫功能的活性成分。 紫外掃描表明， CPIRF 紫外最高吸收峰為 nm，與報(bào)道的動(dòng)物胎盤紫外吸收峰比較接近。 試驗(yàn)試劑 所用 主要試驗(yàn)試劑 見表 12。 Folin酚試劑法操作簡便，靈敏度高，樣品中 多肽或 蛋白質(zhì)含量高于 5 μg 即可測(cè)得，是測(cè)定 多肽或 蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之一。 第 2 章 CPIRF 主要成分分析 17 表 2 1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 試 劑 管 號(hào) 1 2 3 4 5 6 250 μg/ml BSA（ ml） 0 蒸餾水（ ml） 0 蛋白質(zhì)含量（ μg） 0 50 100 150 200 250 CPIRF 多糖含量分析 采用 苯酚 硫酸法測(cè)定 CPIRF 中多糖含量。 釩鉬酸銨顯色法原理 核酸分子中含有一定比例的磷，且含量比較接近和恒定，測(cè)定此磷的量，即可求得核酸的量。 臨用時(shí)準(zhǔn)確稀釋至 100 μg/ml， 20 μg/ml。 7) 無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線：取 、 、 、 、 ml 。以吸光