【正文】 15μ m ~40μ m 3 μ m 填料 粒徑的影響 N Flow 3 181。m 表面積 顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和 , 以 m2/g表示 孔徑 顆粒的孔或腔的平均尺寸 , 范圍 80300197。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。 正相柱：多以硅膠為柱填料。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時，用到底，然后再擰緊空心螺釘。 C 溫度范圍 – 柱后冷卻 ? DAD3000RS檢測器 – 全波長掃描范圍數(shù)據(jù)采集速率 100 Hz ? Acclaim174。弟姆特方程式）。 在實際工作中，常應(yīng)用另一表征色譜分配平衡過程的重要參數(shù) —— 容量因子 (capacity factor)，也稱分配比 (partition ratio)，以 k 表示。 R值越大分離越好，反之則峰重疊愈多。鈍化時使用HNO3在柱管內(nèi)至少滯留 10min，以在內(nèi)壁形成鈍化的氧化物涂層。 色譜柱的構(gòu)造 柱填料： 液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。 （ 2）擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。 C 液相色譜柱的應(yīng)用 三、液相色譜柱的選擇 分離模式的選擇 樣 品 溶于 有機溶劑 溶于 水 溶于四氫呋喃 非離子化 離子化 溶于 有機溶劑 溶于 水 溶于正己烷 溶于甲醇或甲醇 /水 或乙腈或乙腈 /水 用鍵合相的反相模式 用鍵合相的反相模式 低分子凝膠滲透色譜 用鍵合相的反相模式 抑制電離反相鍵合相色譜 用硅膠的正相模式 離子交換模式 凝膠滲透色譜 凝膠過濾色譜 大孔填料的離子交換模式 用大孔填料的反相模式 分子量 2021 分子量 2021 低分子凝膠滲透色 用硅膠的正相模式 用鍵合相的正相模式 ：硅膠 、氧化鋁、聚苯乙烯等（封端技術(shù)） 2. 鍵合相 ： C C C1苯基、氨基等 ： 60100A 分子量 2021 300A 分子量 2021 ： 2um10um ： 10mm以下（分析）， 10mm以上（制備） ： 1 2 30mm 柱子的選擇 性能參數(shù) 正相 amp。m的粒徑 5181。242nm,甲醇 15%→ 60%(25min) C18 *50,。 孔徑可改善大分子的峰形 色譜柱 : x 150 mm, 5 mm 流動相 : 60% MeOH: 40% % 三氟乙酸 流速 : mL/min 溫度 : RT 檢測器 : UV 282 nm ? 溶液中的分子尺寸決定適宜的色譜柱孔徑 ? 窄的峰寬表明待測分子進入填料孔沒有受到阻礙 SBC3 (80197。 溫度： 500C 流速： 保留值與 pH的關(guān)系 1 2 3 4 6 7 5 0 1 2 3 4 5 6 Time (min) 0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 6 7 5 Time (min) pH pH 色譜柱 : ZORBAX Eclipse XDBC8 x 75 mm, 181。 液相色譜柱的使用 新色譜柱的平衡方法： 首先用 ，然后將流速逐步升高到 ，以便將色譜柱的填料充分平衡至最佳狀態(tài)，這樣可以保證色譜柱的使用壽命，并且保證在以后的使用中，獲得分析結(jié)果的重現(xiàn)性。 當(dāng)選用最佳流速時，分析時間可能延長。 ? 檢測波長：不允許改變 五、分析條件調(diào)整的影響 流動相調(diào)整的基本原則（等度） （ 1）由強到弱： 一般先用 90%的乙腈 (或甲醇 )/水(或緩沖溶液 )進行試驗， 這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機溶劑 (乙腈或甲醇 )的比例。 1pH。 色譜柱易出現(xiàn)的問題 ? 譜圖分叉 柱頭塌陷 ? 修 補 前后 現(xiàn) 象 1 3 2 1 3 2 樣 品 問題 2 4 3 1 常 見問題 及解 決 方法 現(xiàn) 象 原 因 解決辦法 峰型不好（分叉、拖尾、前伸） 柱頭塌陷、保護柱和柱子不匹配、污染 見資料 壓力升高 管路、保護柱、柱子堵塞 見資料 壓力過低 漏液 氣泡 見資料 壓力波動 氣泡 見資料 資料 色譜柱子污染對比 ? 正常 污染后 色譜柱的修復(fù) 柱 頭 塌陷修 復(fù)辦 法 ? 擰下柱頭螺帽 (最好在臺虎鉗上 ) ? 用尖針輕輕除掉柱頭表面的污染填料 ? 取少量與色譜柱相同的新填料 ,調(diào)成漿糊狀(正相用正己烷 ,反相用甲醇 ) ? 填實柱頭 (輕輕下壓 ) ? 更換柱頭過濾板 ,將柱頭螺帽擰緊 液相色譜柱再生 反相色譜柱 用以下溶劑至少各 25mL沖洗色譜柱 (分析柱 ) ? 不含緩沖鹽的流動相 ? 100%甲醇 ? 100%乙腈 ? 75%乙腈 +25%異丙醇 ? 100%異丙醇 ? 100%二氯甲烷 ? 100%正己烷 ? 100%異丙醇 ? 100%甲醇 沖洗色譜柱要用比流動相更強的溶劑 液相色譜柱再生 ? 正相色譜柱 ? 用以下溶劑至少各 50mL沖洗色譜柱 (分析柱 ) ? 50%甲醇 +50%三氯甲烷 ? 100%乙酸乙酯 LOGO LiXiaoKuan 。 C USP TF 5% 1. 2. 3. 4. 5. No TEA 10 mM TEA USP TF 5% 1. 2. 3. 4. 5. Time (min) 3 5 4 2 1 樣品 : 1. 去甲麻黃堿 2. 麻黃素 3. 苯丙胺 4. 脫氧麻黃堿 5. 苯丁胺 酸對酸性組分的峰形的影響 色譜柱 :ZORBAX StableBond SBC18 x 150 mm, 5 mm 流動相 : 40% A: 60% ACN 流速 : mL/min. 溫度 : 室溫 樣品 : 異丁苯丙酸， pKa pH 3 5 mM NaH2PO4 Tf = pH 3 5 mM NaH2PO4 1% 乙酸 pH % 三氟乙酸 Tf = Tf = A: ? 乙酸和三氟乙酸均能作為酸填加至流動相中 ? 三氟乙酸由于所需濃度較低 , 可作為首選 柱容量對峰型的影響 mm overloaded mm overloaded mm 液相色譜柱 : ZORBAX Eclipse XDBC18 色譜柱尺寸 : x 250 mm 5181。調(diào)整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。 USP 允許調(diào)節(jié)的色譜條件范圍 ? 色譜柱子長度： 70% ? 色譜柱子內(nèi)徑： 177。 緩沖鹽或離子對試劑度需要較長的時間來平衡 。 C 檢測 : UV 250 nm ? 可電離的組份的分離可能會隨 pH變化發(fā)生顯著變化 —甚至很小的 – 個 pH變化單位 . 樣品 : 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. Hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. Propranolol 7. ibuprofen 個 pH pH值對保留時間的影響 堿性條件保留時間 隨 PH變化明顯 ， PH 變化 ， 保留時間 變化 。) Pw 1/2 = Pw 1/2 = O O N HO HO CHO HO O H O H O O O O O O O CH 3 CH 3