掌握層析chromatography的概念(完整版)
【正文】 同 加以分離的方法 。 由于各組分所受 固定相的阻力 和 流動相的推力 影響 不同 ， 各組分移動速度也 各異 ，從而使各組分得到分離 。 ?.柱層析 （ colum chromatography） 將 固 定 相 裝 在 層 析 柱 中 ， 使樣品 朝著一個(gè)方向移動 ， 通過各組分隨流動相流動而得到分離的方法 。在離子交換層析中 K為交換常數(shù) . 分配系數(shù) K值大 ,說明物質(zhì)在層析中被固定相吸附得比較牢固 ,隨流動相遷移的速度較慢 ,留在固定相中的時(shí)間較長 ,在洗脫液中后出峰。 其又稱為凝膠過濾或 分子篩過濾 或排阻層析 。 ? 外水體積 （ V0） … 即存在于柱床內(nèi)凝膠外 ? 面空隙之間的水相體積 ， ? 相應(yīng)于一般層析法中流 ? 動相的體積 。 Ve Vo Kd = ———— Vi （ 1） Kd = 0時(shí) ,Ve = Vo,意味著該分子完全被排阻于凝膠顆粒之外 ,全部分布于流動相里 ,在固定相分布為 0,而 最先流出 。 （二）缺點(diǎn) 樣品和洗脫液的 粘度很低 。 （ 商品名為 Sepharose) 它是一種 大孔凝膠 ,其工作范圍的下限幾乎是 Sephadex的上限 ,可分離 MW40萬以上 的物質(zhì) ,因此可用來分離核酸及病毒 。 [器材 ] 層析柱（ 25ml） 等 [試劑 ] ： DNP魚精蛋白 、 Hb G50 [操作 ] 1. 裝柱： 在層析柱的底部出口套上乳膠塑料管，向?qū)游鲋鶅?nèi)加蒸餾水趕走在層析柱的死體積和接口處的氣泡，在蒸餾水高度約占體積的 1/3時(shí)，關(guān)閉下端出口，自頂部緩緩加入已處理好的 Sephadex G50懸液，待底部凝膠沉積 1~2cm時(shí)，再打開出口，凝膠加至凝膠沉積離層析柱口約 3cm即可。 茨維特 在當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)中觀察到 6個(gè)色帶，它們分別是胡蘿卜素、葉黃素和葉綠素 A和 B。 2. 加樣：取樣品液 5滴即為上柱樣品。 選擇何種凝膠以及它的型號 ,這需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件 ,溶質(zhì)的分子量的大小和分離工作的目的而定 ,每種型號凝膠都有一定分離溶質(zhì)分子量的范圍 ,選擇的型號凝膠要能滿足實(shí)驗(yàn)要求 。 對某些溶質(zhì)分子具有吸附作用 ,如 芳香族化合物與脂蛋白等 。 （ 4） Kd 1現(xiàn)象說明凝膠對組分有吸附作用 ,此時(shí) VeVo + Vi,例如一些 芳香族化合物 的洗脫體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出理論計(jì)算的最大值 ,這些化合物的 Kd 1如苯丙氨酸 、 酪氨酸和色氨酸 。 ? 凝膠干體積 （ Ｖｇ ） Ｖ Ｔ ＝Ｖ ０ +Ｖ ｉ ＋Ｖ ｇ 洗脫體積與Ｖｏ及Ｖｉ之間的關(guān)系 Ｖｅ＝Ｖｏ＋ＫｄＶｉ Ｋｄ＝ （ Ｖｅ－Ｖｏ ） ／Ｖｉ ? Ｋｄ 為樣品組分的分配系數(shù) ， 也可以說 Ｋｄ是 分子量不同的溶質(zhì)在凝膠內(nèi)部和外部的分配系數(shù) 。 二 .基本原理 流動相（洗脫液） 固定相（凝膠） 原理 ：被分離物質(zhì)中各組分的 分子量不同 。
環(huán)評公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1