科研設(shè)計(jì)書--日本血吸蟲尾蚴性別鑒定應(yīng)用技術(shù)的研究(完整版)
【正文】 關(guān)課題 —— Alzheimer 病的流行病學(xué)調(diào)查，與該課題密切相關(guān)。 3） 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析、處理。腦脊液取材操作簡單，放射免疫法檢測受主觀干擾因素少，結(jié)果可靠。阿爾茨海默病患者腦脊液 Tau、Aβ 1 Aβ 142（ 43） 蛋白測及其臨床意義。臨床神經(jīng)病學(xué)雜志， 2021，1： 35。 AD 患者腦脊液中 Aβ水平是增高 還是降低，各家報(bào)道不一致 [14]。 AD 患者腦細(xì)胞內(nèi) Tau 蛋白磷酸化位點(diǎn)增多， Tau 蛋白呈異常磷酸化，腦 脊液中 Tau 蛋白的含量增多。 2 儀器設(shè)備 主要包括溫控設(shè)備： 4℃、 20℃、 70℃冰箱、 THZ95 型恒溫振蕩器、 SCS24 型搖床、光照培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、微波爐等；凈水設(shè)備： MilliQ 水純化設(shè)備；消毒設(shè)備：高壓蒸氣滅菌鍋；計(jì)量設(shè)備：各種精密度天平、量筒、移液管及各種規(guī)格的可調(diào)試微量移液器、 PH計(jì)、紫外分光光度計(jì)等；離心設(shè)備：各種不同規(guī)格的普通、高速冷凍離心機(jī)；蛋白核酸分析設(shè)備： DYA 瓊脂糖凝膠 電泳儀、多功能蛋白電泳儀（ BioRad）、核苷酸序列分析儀（ BioRad）、核酸蛋白測定儀 (BECKMAN)、快速蛋白液相層析系（ Pharmacia）等；其它分子生物學(xué)儀器：PCR 儀、超聲儀、電穿孔轉(zhuǎn)基因儀、干膠儀、酶標(biāo)儀、凝膠掃描儀、影像密度掃描儀等。 挑選培養(yǎng)出的單個白色菌落，接種于液體培養(yǎng)；用質(zhì)粒 DNA 提取試劑盒提取質(zhì)粒 DNA。如此制備的雌 蟲 DNA 為檢測子，雄蟲 DNA 為驅(qū)動子。 2. 用代表性差異分析方法分離日本血吸蟲雌性特異性序列 感染家兔 4只，每只約用 15001800條尾蚴。 關(guān)鍵技術(shù) 日本血吸蟲雄蟲、雌蟲基因組 DNA 的提取 代表性差異分析方法（ RDA）和 PCR。基于曼氏血吸蟲尾蚴性別鑒定的現(xiàn)有方法，為探索適合日本血吸蟲尾蚴性別鑒定方法提供了理論和方法依據(jù)。由于血吸蟲為兩性染色體的吸蟲，其雄性為同性配子體（ ZZ），而雌性為異性配子體（ ZW）。 登記序號 項(xiàng)目編號 科研設(shè)計(jì)書 項(xiàng)目名稱： 日本血吸蟲尾蚴性別鑒定應(yīng)用技術(shù)的研究 承擔(dān)單位： 單位地址： 郵政編碼： 開 戶 行： 帳 號： 1103021109000077488 項(xiàng)目負(fù)責(zé)人： 電 話： 職務(wù)職稱： 填報(bào)日期 2021 年 7 月 28 日 江蘇省地方病協(xié)會 二 ○○ 四年制 一、 立項(xiàng)依據(jù) ： 血吸蟲是一具有兩性染色體的吸蟲，有 8 對染色體，其中雌性 性染色體為異配子體（ ZW），雄性為同配子體（ ZZ）。 RDA 方法從宏觀上看，系用雄蟲染色體 ZZ去扣除雌蟲染色體中的 Z，從而獲得 W染色體。利用代表性差異分 析（ RDA）方法，分離出日本血吸蟲雌性特異性序列，將此特異性序列制備成 DNA 探針，用 Southern blot 方法鑒定日本血吸蟲尾蚴性別。 低熔點(diǎn)凝膠回收雌性特異性片段 大腸桿菌 TG1 感受態(tài)細(xì)胞的制備技術(shù)、 DNA 的重組和克隆篩選、重組 DNA的轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒 DNA 的提取。 45天后剖殺家兔，收集成蟲，在解剖鏡下將成蟲雌雄分開，分別保存于 70℃液氮中備用。 扣除雜交法及 PCR 取以上的檢測子 1ug 連接新的 適配子接頭（ J Hind24 5’ACCgACgTCgACTATCCATgAACA3’和 J Hind12 5’AgCTTgTTCATg3’）；然后取 帶有新接頭的檢測子與 40ug 的驅(qū)動子溶于 4ul 的 3 EE 緩沖液中，加入 1ul的 5M的 NaCL，扣除雜交， 67℃ 、 20小時；并做 PCR和 瓊脂糖凝膠電泳 。 Southernblot 方法驗(yàn)證：利用 DIG DNA Labeling and Detection Kit制備 DNA探針和 Southernblot驗(yàn)證。 五、 計(jì)劃進(jìn)度 ： 總期限一年： 13 月 采購釘螺，并篩選陰性釘螺。 本研究擬采用放射免疫法檢測不同年齡段人群（包括癡呆和非癡呆）腦脊液 β Aβ 42和 Tau 蛋白含量，通過大樣本的分析，界定其參考正常值范圍，為Alzheimer 病的診斷提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。其原因主要與沒有分別測定 Aβ Aβ 42 和總 Aβ有關(guān)；且因均采用 ELASA 法，測出的結(jié)果受主客觀影響較大，致使 Aβ測定的應(yīng)用價(jià)值降低 。 2． 吳愷，胡剛，國泓，等。徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2021， 2： 109112。 目前，國內(nèi)外關(guān)于腦脊液 Aβ和 Tau 蛋白檢測的報(bào)道主要是對已確診為癡呆的研究，對非癡呆患者 腦脊液 Tau 蛋白和Aβ的檢測的報(bào)道甚少。 4） 書寫論文。 2．實(shí)現(xiàn)本項(xiàng)研究已有的主要儀器設(shè)備，尚缺的儀器設(shè)備及解決途徑 本院核醫(yī)學(xué)科有成套的儀器設(shè)備，已開展放射免疫檢測多年，不缺任何儀器設(shè)備，只需購買相應(yīng)的試劑合。由甲方資助經(jīng)費(fèi)總額 元，分 次拔完，完成全部合同任務(wù)。其研究成果未經(jīng)專家鑒定或未經(jīng) 方同意，不得對外提供成公開發(fā)表具有保密價(jià)值的關(guān)鍵資料、數(shù)據(jù)（包括某些訣竅、方法）。 8．凡未被甲方認(rèn)可的理由，不如期按要求完成合同任務(wù)者，進(jìn)行文字通報(bào)。 3．所 簽定的此項(xiàng)合同課題，乙方不得另向其它部門或 單位申報(bào)計(jì)劃。 實(shí)驗(yàn)材料費(fèi) 小型土建安裝費(fèi) 協(xié)作費(fèi) 1． 0 編程軟件
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