【正文】 噸，其中可提取 幾丁質(zhì) 20 億噸以上，是僅次于纖維素的自然界第二大天然生物有機(jī)資源 [1]。 幾丁質(zhì)酶 （ chitinase） 是一類(lèi)生物代謝的具有廣泛用途的水解酶 ， 它能催化水解真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì) ， 從而抑制真菌生長(zhǎng)與繁殖 [4]。根據(jù)反應(yīng)的最適 pH不同 ， 可將其分為酸性、中性與堿性幾丁質(zhì)酶。 本文對(duì)轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因的酵母工程菌株進(jìn)行 誘導(dǎo)分泌表達(dá) ，分離純化發(fā)酵液中的幾丁質(zhì)酶，測(cè)定它的酶學(xué)性質(zhì)， 為以后該酶的大規(guī)模 開(kāi)發(fā) 利用 提供科學(xué)依據(jù) 。 ④1mol/L K 3PO4：將 g K3PO4溶于 400 mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié) pH 至 ，高壓滅菌 20 min。 ⑤1 mol/L 、 pH TrisHCl 緩沖液：稱取 g Tris，加 800 mL 蒸餾水溶解 ， 再加 70 mL 1 mol/L HCl，混勻后 調(diào)節(jié) pH 至 ，最后加蒸餾水定容至1000 mL。 ③ 在膠體中再加蒸餾水，攪拌后 5000 r/min 離心 5 min，重復(fù)上述過(guò)程至pH 約為 。 主要儀器設(shè)備 Anke DL5B低速大容量離心機(jī)， Anke TGL16C 高速臺(tái)式離心機(jī)， 恒溫水浴鍋，雙層全溫?fù)u床（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）， UV20xx 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)， DYY12 型電腦三恒多用電泳儀 、 WD9412A 型恒溫循環(huán)器、 WD9405A 型脫色搖床 （北京市六一儀器廠），夾心式垂直板電泳槽。 N乙酰氨基葡萄糖（ NAG）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 表 1 NAG 濃度的配制 Tab. 1 Standard curve of NAG 項(xiàng)目 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NAG 標(biāo)準(zhǔn)液（ mL） NAG 的量（ mg） 蒸餾水（ mL） DNS（ mL） ① 配制 1 g/mL N乙酰氨基葡萄糖 （ NAG） 溶液。 酶活性單位（ U）定義為：每分鐘水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1 mg 還原糖所需的酶蛋白量 [8]。 幾丁質(zhì)酶的 SDSPAGE 檢測(cè) 對(duì)純化酶液和 17 d的粗酶液進(jìn)行 SDSPAGE，測(cè)定 表觀 幾丁質(zhì)酶的分子量。 ③ 將 17 d 的粗酶液離心，取 50 μL 上清再加入 50 μL 上 樣緩沖液，對(duì)照組用提純的酶液。 幾丁質(zhì)酶 的酶學(xué)性質(zhì) 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適溫度 將 酶反應(yīng)體系 分別置于 30 ℃ 、 35 ℃ 、 40 ℃ 、 45 ℃ 、 50 ℃ 、 55 ℃ 、 60 ℃ 、65 ℃ 、 70 ℃ 、 75 ℃ 和 80 ℃ 下反應(yīng) 1 h， DNS 法檢測(cè)幾丁質(zhì)酶的活性，確定酶反應(yīng)的最適溫度。 不同金屬離子對(duì)酶活性的影響 在幾丁質(zhì)酶反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子（ Cu2+、 Ca2+、 Mn2+、 Fe2+、 Zn2+、Ba2+、 K+、 Na+、 Ag+、 Mg2+、 NH4+ 、 Hg+）并使其最終濃度為 mol/L，在 50 ℃下反應(yīng) 1 h 后，以 反應(yīng)體系 中 不加金屬離子的酶活 性 為 100％，分別測(cè)定加入不同金屬離子后反應(yīng)體系中幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性。結(jié)果如圖 3 所示，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白（低） 分子量 分別為 、 、 、 、 和 KDa，純化 后酶液有 1 條 清晰地 電泳條帶， 分子量約為 41KDa， 說(shuō)明 GStachit1K 經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生了幾丁質(zhì)酶且分離純化的方法有效。 在 pH 時(shí) 酶活性 小于 20 %。 此外，終濃度為 3 mol/L 的 尿素和 10 mmol/L 的β 巰基乙醇也對(duì)酶有抑制作用 。 此外， SDS、尿素、β 巰基乙醇也對(duì)幾丁質(zhì)酶有抑制作用。 17 熱穩(wěn)定性 實(shí)驗(yàn)中 幾丁質(zhì)酶在 35 ℃ 以 下是穩(wěn)定的，證明 該 酶不具有較高的熱穩(wěn)定性。 幾丁質(zhì)酶對(duì)底物具有一定專(zhuān)一性，一般只可水解粉狀幾丁質(zhì)、膠狀幾丁質(zhì)、可溶性幾丁質(zhì)衍生物及可溶性的幾丁質(zhì)寡糖，而不能水解由幾丁二糖經(jīng)糖苷鍵連接而成的糖類(lèi)，如麥芽糖、淀粉和纖維素等。 致謝 在我進(jìn)行畢業(yè)論文試驗(yàn)的過(guò)程中，我的導(dǎo)師咸洪泉老師給予了我悉心的指導(dǎo)和親切的關(guān)懷。 學(xué)位論文作者（本人簽名）： 年 月 日 學(xué)位論文出版授權(quán)書(shū) 本 人及導(dǎo)師完全同意《中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)出版章程》、《中國(guó)優(yōu)秀 碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)出版章程》 (以下簡(jiǎn)稱“章程” )，愿意將本人的學(xué)位論文提交“中國(guó)學(xué)術(shù)期刊（光盤(pán)版）電子雜志社”在《中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》、《中國(guó)優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》中全文發(fā)表和以電子 、網(wǎng)絡(luò)形式公開(kāi)出版，并同意編入 CNKI《中國(guó)知識(shí)資源總庫(kù)》，在《中國(guó)博碩士學(xué)位論文評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)》中使用和在互聯(lián)網(wǎng)上傳播，同意按“章程”規(guī)定享受相關(guān)權(quán)益。 首先非常感謝學(xué)校開(kāi)設(shè)這個(gè)課題，為本人日后從事計(jì)算機(jī)方面的工作提供了經(jīng)驗(yàn)，奠定了基礎(chǔ)。從他身上，我學(xué)到了許多能受益終生的東西。感謝老師四年來(lái)對(duì)我孜孜不倦的教誨，對(duì)我成長(zhǎng)的關(guān)心和愛(ài)護(hù)。在論文的撰寫(xiě)過(guò)程中老師們給予我很大的幫助，幫助解決了不少的難點(diǎn)，使得論文能夠及時(shí)完成，這里一并表示真 誠(chéng)的感謝。 最后，我要特別感謝我的導(dǎo)師趙達(dá)睿老師、和研究生助教熊偉麗老師。 最后，我要感謝我的父母對(duì)我的關(guān)系和理解，如果沒(méi)有他們?cè)谖业膶W(xué)習(xí)生涯中的無(wú)私奉獻(xiàn)和默默支 持，我將無(wú)法順利完成今天的學(xué)業(yè)。這期間凝聚了很多人的心血，在此我表示由衷的感謝。 本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。 參考文獻(xiàn) [1] 吳東儒 .糖類(lèi)的生物化學(xué) [M].北京 :高等教育出版社 ,1987,349352. 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