【正文】 基因變異體 （ 體細(xì)胞父源和母源；正常和突變基因 ） ；從遺傳學(xué)上來(lái)說(shuō) ， 基因代表一個(gè)遺傳單位 ， 一個(gè)功能單位 ， 一個(gè)突變單位 。 － Cohen 1973年 ， Cohen Group將 tetr質(zhì)粒psclol和 nersrR63質(zhì)粒體外限制酶切割 ， 連接成一個(gè)新的質(zhì)粒 ， 轉(zhuǎn)化 ， 在含四環(huán)素和新霉素的平板上篩選出了 terrNer,實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)移 。 而時(shí)至今日 ， 幾乎一發(fā)不可收拾 。 這樣一只與第一只羊基因百分之百一樣的復(fù)制品誕生了 。 超越時(shí)代的科學(xué)成就往往不易被人們接受 ，Avery當(dāng)時(shí)并未贏得陣陣掌聲 ， 他的論文事隔 10年以后才公開(kāi)發(fā)表 。 （ 3） 然而 ， 直到 1973年 Cohen才能將質(zhì)粒作為基因工程載體使用 （ 至今一直是基因工程最重要最廣泛使用的載體 ） 。 18 五 ． 與基因工程相關(guān)的概念： （ 一 ） 克隆 （ clone,cloning） ： 。 19 （ 二 ） 重組 DNA技術(shù) (DNA rebination technique) 是用酶學(xué)的方法將不同來(lái)源的 DNA在體外切割 ， 連接組成一個(gè)雜合的 DNA分子的技術(shù) 。 并切割 dsDNA。 23 (二 )限制酶的識(shí)別位點(diǎn) 1． 一般特征 （ 4點(diǎn) ） ： （ 1） Ⅱ 型酶 識(shí)別的特殊 DNA序列 稱為限制酶的識(shí)別位點(diǎn) （ 或切割位點(diǎn) ） 。 如： GTYRAC Y=C或 T R=G或 A YR=CG或 CA或 TG或 TA Hin Ⅱ 實(shí)際上可以識(shí)別 4個(gè)特定序列 。 ） BamHⅠ G↓GATCC 由此產(chǎn)生的 DNA片段可借粘性末端相互連接 ， Sau 3A N↓GATCN 在 DNA重組時(shí)具有更大的靈活性 。 （ 二 ） 來(lái)源 －噬菌體 T 4感染 E c o li分離的一種單鏈多肽酶 、。 逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶 ， 它的酶活性有： 以 mRNA為模板合成 cDNA DNApol 以 ssDNA為模板 ， 3′－ OHDNA片段為引物 ， 按5′→3′合成 DNA鏈 。 其 dsDNA外切活性可被 5′→3′聚合活性所抑制 。 在減法反應(yīng)中從 4個(gè)反應(yīng)混合物中每 4個(gè) dNTP中減去 1個(gè) 。 (4)在 Sanger雙脫氧法 ddNTP系統(tǒng)進(jìn)行序列分析 。 該酶的主要用途是進(jìn)行PCR反應(yīng) （ 詳參聚合酶鏈 ， polymerase chain reaction） 1969年在美國(guó)黃石公園溫泉分離出一種嗜熱真菌，即水生棲熱菌株（ thermus aquaticus strain,TYC），該菌能在 70℃ －75℃ 生長(zhǎng)，已經(jīng)克隆化該菌的基因， cetus公司首次分離純化了該酶，商品名為 Taq DNA polymerase，分子量 94KD，－ 20℃ 至少可貯存 6個(gè)月，由于 Taq DNA polymerase能抵抗鏈分離所需要的高溫（ 94℃ －95℃ ）的反復(fù)處理，故只需在第一次熱變性后，加一次酶，即可以進(jìn)行 30－ 40次循環(huán)，簡(jiǎn)化加快了操作程序，實(shí)現(xiàn)了 PCR的自動(dòng)化，耐熱酶還有 VENT、 sac等，以 Taq應(yīng)用最廣。 （ 5） 忠實(shí)性 評(píng)價(jià)一個(gè) DNApol的忠實(shí)性在于檢測(cè)復(fù)制過(guò)程中核苷酸錯(cuò)誤摻入的頻率 ， 酶的忠實(shí)性是一個(gè)關(guān)鍵特性 ， 尤其是 PCR擴(kuò)增物進(jìn)行DNA序列分析時(shí)就顯得尤為重要 。 （ 一 ） 核酸酶 SI(SI核酸酶 ， nuclease SI， SI， 常用的核酸酶 ) 源于米曲霉素 （ aspergillusoryzas） ssDNA、 ssRNA、 dsDNA、 或 DNARNA雜交鏈 。 （ 2） 內(nèi)切核酸酶活性： DNA的單鏈區(qū)；底物 DNA螺旋構(gòu)象有所改變的雙鏈區(qū) 。 32p存在時(shí)，用于標(biāo)記 DNA分子的 3’末端。 vector實(shí)際上是 DNA分子 ， 是用來(lái)攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的 DNA 48 二、載體的分類 分類依據(jù) 類 別 克隆擴(kuò)增或表達(dá) 舉 例 （ 1） 克隆載體 （ 2） 表達(dá)載體 √ √ PBR322 PCDN3 型分 （ 1） 原核載體 （ 2） 真核載體 （ 3） 穿梭載體 PUC8 PBUDCE41 YE 病毒載體＋ （克隆能力）分 (1)1kb (2)10kb (3)22kb (4)50kb (5) (6) ( 1 )M13 (2)plasmid (3)λ phage (4)casmid ( 5 ) B A C (6)YAC √ 49 說(shuō)明： （ sbuttle vector） 指在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子 ， 因而可以運(yùn)載目的基因（ 穿梭往返兩種生物之間 ， 如： YEP,DIDB219 Yeast Artificial Chromsome 由酵母基因和 PBR322質(zhì)粒衍生物構(gòu)成 ， 對(duì)克隆大的真核基因十分有用 ， 在 HGP中發(fā)揮主要作用 。 它是用來(lái)克隆和擴(kuò)增 DNA片段 （ 基因 ） 的載體 。 54 －復(fù)制起始點(diǎn) （ origin， ori） （ 1） 決定質(zhì)粒自我增殖和拷貝數(shù)的主要元件 。 ③ 分子量小 ， 不具備自傳遞能力 。 （ 3） 人工接頭 （ linker） 是用若干個(gè) bp組成的 dsDNA片段 ， 一般有一個(gè)或以上限制酶識(shí)別與切割的順序 。 ④ 啟動(dòng)子是可以接受調(diào)控的 ， 可以被改造的 。 5 。 （ 3） 增強(qiáng)子的作用機(jī)制： ① 改變 DNA的螺旋結(jié)構(gòu) ， 使其成柔曲線－ 拉近 E/P距離； ② 為 DNA模板提供某一特定空間微環(huán)境－ 促進(jìn) top異構(gòu)酶改變DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)； ③ 為 RNA pol和反式作用因子提供一個(gè)與順式元件聯(lián)系的結(jié)構(gòu) 。 64 7． 轉(zhuǎn)錄終止順序 （ 終止子 ） /翻譯終止密碼子 （ terminator o transcrition，term terminator of translation, terminator codon,stop codon） ： （ 1） 轉(zhuǎn)錄終止子 /term 指一個(gè)基因編碼區(qū) down stream的 DNA順序 ，可被 RNA pol識(shí)別為停止合成 mRNA的信號(hào) 。 66 第四節(jié) 重組 DNA技術(shù)的基本過(guò)程 基因工程包括 3個(gè)步驟： 1． DNA重組 2． 重組 DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞－克隆擴(kuò)增或表達(dá) 3． 基因工程的后處理 （ down－ stream techniques of GE） 重組 DNA技術(shù)的基本過(guò)程： 1． 載體的選擇和制備 —— 分； 2． 制備目的基因片段 —— 切； 3． DNA片段的重組連接 —— 接； 4． 重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞 —— 轉(zhuǎn)； 5． 轉(zhuǎn)化子的篩選 —— 篩； 6． 重組子的篩選 —— 篩； 7． 重組子的鑒定 —— 鑒； 8． 克隆擴(kuò)增或表達(dá) —— 擴(kuò) /表達(dá)； 9． 基因工程的后處理 —— 分 。 ） 65 8． 加 poly（ A） 尾信號(hào) 結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA的保守序列 ， 此位點(diǎn) down－ stream有一段 GT或 T富豐區(qū) ， 這 2部分共同構(gòu)成 poly（ A）加尾信號(hào) 。 由于 － L Dagarne（ 1974） 首先發(fā)現(xiàn) ， 故名 。 即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用 。 分解代謝系統(tǒng)： CAP－cAMP－ 激活 P （啟動(dòng)子 ）－ 促進(jìn)轉(zhuǎn)錄 阻遏物－ R調(diào)節(jié)基因 R編碼產(chǎn)物產(chǎn)生阻遏蛋白－ 結(jié)合在 O上 （ 操縱基因 ） －阻止轉(zhuǎn)錄 存在乳糖時(shí)－ 乳糖－ 結(jié)合阻遏蛋白－ 解除對(duì)轉(zhuǎn)錄阻遏－ 開(kāi)始轉(zhuǎn)錄 2 ． L a c －uv5 是一個(gè)突變?nèi)樘遣倏v子 I P I G 是 β－半乳糖苷酶底物類似物－ 它能與阻遏蛋白結(jié) 合 － 使 O 成游離狀態(tài) 對(duì)分解代謝抑制不敏感－ 即使沒(méi)有 CAP－cAMP－ 轉(zhuǎn)錄照常進(jìn)行 據(jù)報(bào)首 Lac組建載體在原核細(xì)胞表達(dá)時(shí)IPTG可提高真核基因表達(dá)水平 50倍。 ④ DNA分子一個(gè)與啟動(dòng)子基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)的區(qū)域 ， 包括 RNApol識(shí)別 ， 結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始 3個(gè)功能部位 。 （ 3） camr 乙酰轉(zhuǎn)乙酶 生成氯霉素羥乙酰基衍生物 ， 使之 失去毒性 。 （ 5） 基因工程使用松弛復(fù)制子 ， 以獲得更多的基因產(chǎn)品 。 52 （二）載體的元件及性質(zhì) 克隆載體 ori→ Amp→ Mcs P → Rbs/SDs → Mcs → terms 真核表達(dá)元件 P/E → Mcs → terms → 加 poly（ A）信號(hào) 克隆載體元件以及性質(zhì) E． coli表達(dá)載體 哺乳動(dòng)物質(zhì)粒細(xì)胞表達(dá)載體 1. Ori 能在受體細(xì)胞中復(fù)制 ， 含有復(fù)制位點(diǎn) （ 起點(diǎn) ） 2. Ampr 抗生素抗性基因可以便 利加以檢測(cè) 3. MCS 多克隆位點(diǎn) ， 克隆攜帶 外源基因片段 4. 載體可導(dǎo)入宿主細(xì)胞 （ 生物學(xué) /非生物學(xué)方法 ） 1. Ori 4. Promoter 5. SDs Rbs 在 始位點(diǎn) 細(xì)菌抗生素抗性基因 真核細(xì)胞 （ 哺乳類 ）藥物抗性基因 真核細(xì)胞復(fù)制起始位點(diǎn) 多克隆位點(diǎn) 6. P/E 啟動(dòng)子 /增強(qiáng)子 7. Terms 終止信號(hào) 8. 加 poly（ A） 信號(hào) 9. 可導(dǎo)入真核細(xì)胞 （ 哺乳類 ） （ 7－ 8別為轉(zhuǎn)錄翻譯終止密碼， 真核細(xì)胞表達(dá)元件 。 （三）都能容易進(jìn)入宿主細(xì)胞中去，也易從宿主細(xì)胞中分離純化出來(lái)。 （三） 32p標(biāo)記 5ˊ — 末端前，先用其去除 DNA或 RNA上的 5 ˊ P。 43 六 、 末端轉(zhuǎn)移酶 （ TTE） （ 一 ） 來(lái)源 小牛胸腺 。 ③ 分析 DNA： RNA雜交體結(jié)構(gòu) ， 可證明基因內(nèi)部?jī)?nèi)含子的存在（ 當(dāng)一條 DNA與它的 mRNA雜交時(shí) ， 如果雜交鏈中有 RNA－ loop環(huán) ，SI可切開(kāi)這個(gè)環(huán) ， 這是基因中有間隔順序證明 。 40 （ 五 ） T4噬菌體 DNA聚合酶 （ T4 DNA pol） 源于 T4噬菌體感染的 。 （ 3） 延伸長(zhǎng)度 PCR有時(shí)需要擴(kuò)增 1kb的片段 ， 這就要求選用DNApol具有較強(qiáng)的延伸能力 。 可用于拷貝長(zhǎng)段模板的引物延伸反應(yīng) 。 該酶是枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解 DNA polⅠ 所得到的 。 ① Sauger雙脫氧法 DNA polⅠ 參入了 2’ 3’ －雙脫氧核苷酸到相應(yīng)的融合了的引物中 ， 從而終止了鏈的進(jìn)一步延伸 ， 這樣每個(gè)大小不同片段都帶有 ddNTP。 32 四 、 DNA聚合酶： DNA聚合酶以 DNA為模板合成 DNA， 基因工程常用的酶有： （ 一 ） 大腸桿菌 DNA聚合酶 Ⅰ （ DNA polⅠ ） 1956年 ， 。 該酶在逆轉(zhuǎn)錄病毒 （ retro virus） 生產(chǎn)循環(huán)中起主宰作用 。 所以這方面資料極少 （ 全球 1－ 2人 ） 。 1． 異源同工酶 （ Isoschizomers:來(lái)源不同 ， 識(shí)別順序相同 ， 切割方式可同可不同： (1)識(shí)別順序與切割方式同 ， 如： MboⅠ 5′和 SauSⅠ 3′（ － NN↓GATCNN3′） NNCTAG↓NN5′ (2)識(shí)別順序同 ， 切割位點(diǎn)不同 ， 如： SmaⅠ 和 XmaⅠ CCC↓GGG C↓CCGGG (3)識(shí)別與切割相同 ， 但其中一酶可以切 “ 修飾 ” （ 甲基化 *） ， 另一酶不能 。 如： GC