7重組體克隆的篩選和鑒定-文庫(kù)吧在線(xiàn)文庫(kù)
【正文】 （ 3）環(huán)絲氨酸： 3. 選擇過(guò)程： 如果在 Tetr上插入外源 DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用 四環(huán)素加環(huán)絲氨酸 平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。 Tetr上有插入位點(diǎn) BamH I和 Sal I。 二、 ?半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法 ?半乳糖苷酶 乳糖 半乳糖 葡萄糖 Xgal 半乳糖 5溴 4氯靛藍(lán) + + 深藍(lán)色 1. 原理： 載體 上有一段 ?半乳糖苷酶基因（ Lac Z）的 ?片段（氨基端），其上有外源 DNA的插入位點(diǎn)。 轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)的外源基因產(chǎn)物能夠彌補(bǔ)受體菌株的突變型缺陷。 2. 過(guò)程 （ 1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或 DNA） 。 （ 2）非放射性標(biāo)記 熒光素 二、核酸雜交檢測(cè)方法 用 DNA（或 RNA）探針檢測(cè) DNA樣品。 缺點(diǎn)：需要電鏡！ 2. Northern blotting 用 DNA（或 RNA）探針檢測(cè) RNA樣品。 1. 原理 抗原 —— 抗體凝集反應(yīng)。 （ 2）一抗結(jié)合 一抗 加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。 Western Blot基本原理是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。 一克約為 6 1023道爾頓 Dalton SDS PAGE ③ 凝膠中的蛋白質(zhì)染色： 考馬斯亮藍(lán)： 靈敏度底、只能檢出 ，但可褪色回收。 3）用二抗與一抗結(jié)合（ 二抗上帶有 HRPO）。 二、轉(zhuǎn)譯篩選 mRNA 無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng) 35S標(biāo)記的 甲硫氨酸 翻譯 35S標(biāo)記的肽鏈 PAGE電泳 放射自顯影 比較放射性 帶紋的位置 載體 +外源 DNA 轉(zhuǎn)錄 與預(yù)期的產(chǎn)物分子量相符？ 三、雜交抑制轉(zhuǎn)譯法 mRNA一旦與 DNA雜交成 RNADNA雙鏈后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)譯被抑制）。 dUMP dATP TTP dCTP 次黃嘌呤 補(bǔ)救 氨甲喋啉 抑制 抑制 ① HAT培養(yǎng)基： Tk 細(xì)胞株。 ② 胸腺嘧啶和次黃嘌呤補(bǔ)救 dUMP dATP TTP dATP 次黃嘌呤 補(bǔ)救 胸苷 補(bǔ)救 無(wú)四氫葉酸提供甲基， dNTP合成受阻 時(shí)， 胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補(bǔ)救 : DHFR細(xì)胞株（不能在 無(wú)核苷酸 的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)）。 G418 真核細(xì)胞 死亡 G418 存活 neor 真核細(xì)胞 含 致死劑量 G418的完全培養(yǎng)基。 （ 5） CAT分析方法 ② 免疫學(xué)檢查： 用抗 CAT的血清進(jìn)行 Western blot或ELISA，檢查 CAT的表達(dá)。 氯霉素 cat 含氯霉素的完全培養(yǎng)基。 ④ 載體標(biāo)記 只有轉(zhuǎn)入 DHFR+基因的細(xì)胞才能生存。 20 真核細(xì)胞核苷酸的合成需要 四氫葉酸 提供甲基。 待測(cè)蛋白質(zhì) 硝 酸 纖 維 素 濾 膜 能與蛋白質(zhì)結(jié) 合的 DNA序列 放射性標(biāo)記 待測(cè)蛋白質(zhì) 硝 酸 纖 維 素 濾 膜 能與蛋白質(zhì)結(jié) 合的 DNA序列 放射性標(biāo)記 五、 DNA蛋白質(zhì)相互作用篩選法 一般克隆與篩選策略 第七節(jié) 幾種常用的真核生物重組基因選擇方法 真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。 ③ Blotting過(guò)程 Immuno Blotting ④結(jié)果 : 多克隆抗體Blotting的結(jié)果 單抗 blotting結(jié)果 一、無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng) 第六節(jié) 轉(zhuǎn)譯篩選法 能把外源的 mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物。 ① Western（轉(zhuǎn)膜） 膠里的蛋白質(zhì)帶在電場(chǎng)的作用下 橫向 轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放
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