生物化學(xué)蛋白質(zhì)(2)-文庫吧在線文庫
【正文】 鹽析： 向蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的中性鹽，可有效地破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化層，同時(shí)中和了蛋白質(zhì)的電荷，降低了蛋白質(zhì)的溶解度，從而使蛋白質(zhì)沉淀。 通常這種沉淀為變性的，如控制溫度（低溫）并控制重金屬離子濃度，則可用于分離制備不變性的蛋白質(zhì)。 化學(xué)因素有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、胍、去污劑、重金屬鹽、三氯醋酸、磷鎢酸、苦味酸、濃乙醇等。在復(fù)性過程中，不同的蛋白質(zhì)充分體現(xiàn)出自身的特性， 沒有可以通用的方法 。 一個(gè)為固定相的或靜相；一個(gè)為流動相或動相 。 氨基酸在濾紙上移動的速度稱為比移值或遷移率，以符號 Rf代表。帶有正電荷的樹脂稱之為陰離子交換樹脂。 分離提純某一種蛋白質(zhì)時(shí)，首先要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。 在抽提過程中，應(yīng)注意選擇合適的溫度條件，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性。 ③離心法 蔗糖濃度％ 4％ 8％ 12％ 16％ 20％ 塑料離心管 滴加樣品 ?蛋白質(zhì)的位置決定于它的大小，密度。 （ 2）利用溶解度差別的純化方法 當(dāng)溶液的 pH與蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)相同時(shí)，蛋白質(zhì)分子呈現(xiàn)電中性，分子間無斥力，分子易于積聚和沉淀，此時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度是最小的，這種使蛋白質(zhì)沉淀的方法稱為 等電點(diǎn)沉淀。 在一定的 pH溶液中，蛋白質(zhì)的遷移方向取決于它們帶電的性質(zhì)和數(shù)量，同時(shí)也受蛋白質(zhì)形狀的影響。 硅膠、氧化鋁、活性炭等物質(zhì)為固體吸附劑，能夠?qū)⑵渌肿游皆诒砻妗? ?在 540 nm處測定其吸光值 ， 此值與蛋白質(zhì)的含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系 。 其顏色在595nm的光波下 ， 有強(qiáng)烈吸收峰 。 溶解的蛋白質(zhì)量 加入的固體蛋白質(zhì)的量 2．電泳法 ?“ 電泳法 ” 只是一個(gè)相對的概念 ， 因?yàn)樵诓煌С治锷?， 電泳分離的效果不一樣 。 ?免疫化學(xué)法是鑒定蛋白質(zhì)純度的有效方法， 它根據(jù)抗原與抗體反應(yīng)的特異性 ， 可用已知抗體檢查抗原或已知抗原檢查抗體 。 4．免疫學(xué)方法 ?蛋白質(zhì)往往具有抗原性 ， 用瓊脂免疫擴(kuò)散或免疫電泳法 ， 蛋白質(zhì) （ 抗原 ） 與抗血清 （ 抗體 ） 之間可產(chǎn)生沉淀線 。 ?因此 ， 可用 BCA法來測定蛋白質(zhì)含量 。 ?此法比雙縮脲法靈敏 100倍 。 （ 5）利用對配體的特異親和力的純化方法 親和色譜顆粒 三、蛋白質(zhì)的定量檢測 1．凱氏定氮法 2．紫外 分光光度計(jì)法 3．雙縮脲法（ Biuret法） 4． Folin酚試劑法（ Lowry法） 5．考馬斯亮藍(lán) G250染色法（ Bradford法） 6． BCA法 1．凱氏定氮法 ?原理： 氮在蛋白質(zhì)分子中含量恒定 （ 平均占 16%） ， 因此測出樣品中氮的含量后 ， 即可求得樣品中蛋白質(zhì)含量 。 不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)分子在等電聚焦電泳結(jié)束后，會分別聚集于其等電點(diǎn)的位置，這樣不同的蛋白質(zhì)分子就得以分離。 （ 2）利用溶解度差別的純化方法 與水混溶的有機(jī)溶劑能減少水和蛋白質(zhì)間的作用力，使蛋白質(zhì)脫水。 ④凝膠過濾法 （ 3）根據(jù)電荷不同的純化方法 A 裝好的凝膠過濾層析柱； B 蛋白質(zhì)混合物上樣； C 不同大小的蛋白質(zhì)分子通過層析柱； D 蛋白出峰圖； ④凝膠過濾法 利用凝膠過濾層析，除了可以進(jìn)行混合物的分離外，還能測定樣品的相對分子質(zhì)量。 （ 1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法 ②超濾 利用一定的壓力使樣品通過半透膜，這時(shí)，小分子和水組成的溶質(zhì)可以被濾過，而大分子的蛋白質(zhì)則留在膜內(nèi)，這種方法稱為超濾法，亦稱微濾法。 方便有效的方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進(jìn)行分離。 高效液相色譜（ HPLC）采用了高壓泵、高效分離柱、高靈敏度檢測器等，使分離效能、分析速度、檢測靈敏度比經(jīng)典液相色譜有了很大的提高。 （ 2）薄層層析 （ 3）離子交換層析 離子交換層析是一種用離子交換劑作為支持劑的層析方法。紙層析以 有機(jī)溶劑為流動相 ，也稱為層析液，在毛細(xì)拉力的作用下，層析液能不斷由下向上流動。 五、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 原理 :蛋白質(zhì)分子中含有許多和 雙縮脲 結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應(yīng)，形成紅紫色混合物。 ④生物化學(xué)性質(zhì)的改變
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