【正文】 都屬于高產(chǎn)值 小體積的范疇。單細(xì)胞蛋白質(zhì)的擴(kuò)大生產(chǎn)前，曾作過(guò)類(lèi)似的嘗試。在改進(jìn)洗滌劑的生產(chǎn)工藝后，在添加酶，使酶的生產(chǎn)規(guī)模又得到恢復(fù)。發(fā)酵罐的表面積也是與 r2 成比例。在 1977 年最大的醋酸生產(chǎn)罐容積是 50M3。在另外一些釀造廠(chǎng)中，則采用許多個(gè)較小的容器以應(yīng)付不同的啤酒品種的需求變化。如采用塔式發(fā)酵罐，其主要優(yōu)點(diǎn)是節(jié)約操作成本，這是由于省略了機(jī)械攪拌，減少了冷卻水的耗用量而節(jié)省了電力和冷卻水費(fèi)用。在英國(guó)的釀造業(yè)中還在使用 50~100 年前的設(shè)備。天然物料如果是季節(jié)性的，則需要貯存而大大增加了投資費(fèi)用。在核算成本時(shí)，必需注意培養(yǎng)基中碳源的消耗量。但距工業(yè)實(shí)踐還有一段距離，而甲烷和甲醇用于大規(guī)模發(fā)酵過(guò)程中是十分經(jīng)濟(jì)的。 第七節(jié) 空氣滅菌 供應(yīng)大量的滅菌空 氣，是需要發(fā)酵時(shí)所具有的獨(dú)特的問(wèn)題。 將壓縮空氣通過(guò)纖維或顆粒物質(zhì)的深床過(guò)濾，是最普通的空氣除菌方式。即使過(guò)濾介質(zhì)是可以清洗后重復(fù)使用，則還有正常的損耗和破裂而應(yīng)考慮折舊費(fèi)用。在單細(xì)胞蛋白質(zhì)生產(chǎn)工廠(chǎng)的投資中，冷卻設(shè)備費(fèi)用約占總投資數(shù)的 10~15%。為保持發(fā)酵罐內(nèi)部的正壓，在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，可從另一個(gè)發(fā)酵罐中引入經(jīng)過(guò)過(guò)濾的二氧化碳和氫。根據(jù)六十年代的報(bào)道，青霉素發(fā)酵時(shí)，通氣量為 ~1vvm時(shí)，每小時(shí)，每 455 升培養(yǎng)基的攪拌成本為 ~ 便士。用碳?xì)浠衔镒鳛榈孜锏陌l(fā)酵罐的設(shè)計(jì)更為復(fù)雜。在 ICI 公司所用的公用系統(tǒng)費(fèi)用只占制造成本的 14%?；盍?qiáng)的接種物，可以縮短延滯期tL；這也相當(dāng)于分離得一株生長(zhǎng)速度快或高產(chǎn)菌株。在細(xì)胞的生產(chǎn)過(guò)程中，有些醇類(lèi)和有機(jī)酸是發(fā)酵時(shí)的主要生產(chǎn)成本，其轉(zhuǎn)化 產(chǎn)量更為重要。 第十二節(jié) 產(chǎn)物提取和收集的成本 雖然對(duì)某些過(guò)程中產(chǎn)物的提取和收集成本作過(guò)討論，但發(fā)表的資料極少。 Atkinson 和 Mavituna（ 1983）曾提出： 1，乙醇的售價(jià)為 220 英鎊 /噸，使用當(dāng)?shù)氐奶妓衔锷a(chǎn)、培養(yǎng)液中乙醇含量在 7%（ W/V）時(shí)，提取產(chǎn)物的費(fèi)用限于 40 英鎊 /噸 以下； 2，單細(xì)胞蛋白質(zhì)的售價(jià)為 300 英鎊噸，以石油為基本底物，轉(zhuǎn)化產(chǎn)率為 3%（ W/V）時(shí)，收集產(chǎn)物的費(fèi)用限于 100 英鎊噸以下； 3，有機(jī)酸或甘油的售價(jià)為 700 英鎊 /噸，在碳水化合物培養(yǎng)基中產(chǎn)物濃度為 10%時(shí)，提取收集產(chǎn)物的費(fèi)用限于 300 英鎊 /噸以下。在大規(guī)模的單細(xì)胞蛋白質(zhì)生產(chǎn)過(guò)程中，一個(gè)年產(chǎn)量 10 萬(wàn)噸的工廠(chǎng)，將水重復(fù)利用，可使水的消耗量降低至每天 10 萬(wàn)噸。 Pape 指出最廉價(jià)的處理方法是控制堆積量，隨后再予以焚燒，或堆放在廢棄的鹽礦中。 3 試劑 （ 1） 硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 配制： 溶 26 克硫代硫酸鈉及 克無(wú)水碳酸鈉于 1000ml 水中。 （ 4） 30%醋酸溶液 取 無(wú)水乙酸，用水定容至 100ml. （ 5） 斐林溶液 A. 硫 酸銅溶液 溶 克硫酸銅于水中，稀釋至 。 n 或 總還原糖（麥芽糖， g/100g 浸出物）＝ 式中： f—— 斐林溶液系數(shù) n—— 稀釋倍數(shù) G—— 麥芽汁中浸出物含量（ %） D—— 麥芽 汁 20℃比重 注意事項(xiàng)： （ 1） 本測(cè)定的操作條件必須嚴(yán)格控制，加熱時(shí)間、滴定速度每次測(cè)定都必須一致，由沸騰至滴定完畢必須在 3min 內(nèi)結(jié)束，否則應(yīng)重做。 標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液稀釋液：取 標(biāo)準(zhǔn)溶液，在 100ml 的容量瓶中稀釋到刻度。 n 1000179。通汽預(yù)熱后，置 25mL容量瓶于冷凝器出口接受餾出液，外加冰浴冷卻，加 2～ 4 滴消泡劑于 100mL 量筒中，再注入未經(jīng)除氣的預(yù)先冷至 5℃左右的酒樣 100mL，迅速移入已預(yù)熱的蒸餾器內(nèi)，并用少量水沖洗帶塞漏斗，蓋塞。 ，附電磁攪拌器 ； 恒溫水?。壕?77。用水清洗電極， 并用濾紙吸干附著電極的液珠。 ℃； 容量瓶： 100mL ； 移液管： 100 mL ； 分析天平，感量 ； 天平：感量 ； 附溫度計(jì)密度瓶： 25mL 或 50mL； 數(shù)字密度計(jì)和注射器。 根據(jù)相對(duì)密度 2020d 查附錄 A，得到餾出液的酒精度， %(V/V)或 g/100mL。所得結(jié)果應(yīng)表示至兩位小數(shù)。 或用已知質(zhì)量的蒸發(fā)皿稱(chēng)取試樣 ，精確至 ，于沸水浴上蒸發(fā)， 直至原體積的 1/3，取下冷卻，加水恢復(fù)至原質(zhì)量，混勻。 P [％ (m/m)] 。 P [ %(m/m)] ； Z —— 啤酒的真正濃度，176。 3 實(shí)驗(yàn)室提供條件 大米、二級(jí)麥芽，高溫淀粉酶，啤酒釀造復(fù)合酶，細(xì)菌中性蛋白酶。在此條件下失去的重量不僅是水分，還有微量的揮發(fā)性物質(zhì)。甲液為硫酸銅溶液，乙液為氫氧化鈉與酒石酸鉀鈉溶液。 20％氫氧化鈉溶液 稱(chēng)取 200 克氫氧化鈉，用水溶解并稀釋至 1000 毫升。 斐林試劑的校正 吸取斐林試劑甲、乙液各 5 毫升，置入 250 毫升三角瓶中，加 20 毫升水，并從滴定管中加入約 24 毫升 ％標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液 (其量應(yīng)控制在后滴定時(shí)消耗 ％標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液在 1 毫升以?xún)?nèi) )，搖勻，于電爐上加熱至沸，并保持微沸 2 分鐘。 Cu2O+K4Fe(CN)6+H2O=K2Cu2Fe(CN)6+2KOH (淡黃色 ) 2 試劑 斐林試劑 甲液：稱(chēng)取 35g 硫酸銅， 次甲基藍(lán)，用水溶解并定容至 1000ml。平行測(cè)定的滴定毫升數(shù)相差不應(yīng)超過(guò) ，故在標(biāo)定、預(yù)備、正式測(cè)定過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)力求一致。用碳酸鈉堿化，再加入福林試劑使之發(fā)色，用分光光度計(jì)或光電比色計(jì)測(cè)定。冷卻后，定溶至 1000ml。 2%酪蛋白溶液 稱(chēng)取干酪素 2g 加入 (必要時(shí)用小火加熱煮沸 )，然后用 乳酸 乳酸鈉緩沖 液定容至 1000mI 即成。搖勻置于水浴鍋中， 40℃保溫發(fā)色20min，在于波長(zhǎng) 660nm處測(cè)定吸光度。分別吸取 1ml 清液，加 碳酸鈉溶液，最后加入 1ml 福林 酚試劑，搖勻，于 40℃水浴中顯色 20min。 （ 2）當(dāng)用不同產(chǎn)品的酪蛋白對(duì)同一蛋白酶測(cè)定時(shí)，其結(jié)果會(huì)有差異，故蛋白酶活力表示時(shí)應(yīng)注明所用酪蛋白的生產(chǎn)廠(chǎng)。 。本溶液需每月標(biāo)定一次。 3 操作方法 待測(cè)酶液的制備 取發(fā)酵液的濾液用 醋酸鈉緩沖液適當(dāng)稀釋?zhuān)y(cè)定用。 VVNN 2 11 ??碘的摩爾濃度 式中 N1：硫代硫酸鈉的濃度 (mol/L) V1：消耗硫代硫酸鈉的毫升數(shù) V：碘液毫升數(shù) 稱(chēng)取 4g 氫氧化鈉 (NaOH)加蒸餾水溶解，定容至 1000ml。在暗處放置 10min 后用蒸餾水 250ml 稀釋?zhuān)么艘旱味ㄖ两K點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液 3ml，繼續(xù)滴 定至藍(lán)色消失而顯亮綠色。上述緩沖液應(yīng)以酸度計(jì)或精密試紙校正 pH。 4 計(jì)算 蛋白酶活力單位定義：在 40℃， 下，每分鐘水解酪蛋白釋放 1 微克酪氨酸的酶量定義為 1 個(gè)蛋白酶單位。將濾液稀釋一定倍數(shù) (使其測(cè)定光密度在 ~ 范圍內(nèi)為宜 )。 3350 酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，應(yīng)加弄乳酸 2~3 滴濕潤(rùn)。 稱(chēng)取無(wú)水碳酸鈉 (Na2CO3)，定容至 1000m1。 2H2O)100g，鎢酸鈉(NaMoO4178。 (4)滴定至終點(diǎn)藍(lán)色褪去之后，就不應(yīng)再滴定，因四甲基藍(lán)指示劑被還原褪色后，當(dāng)接觸空氣時(shí)，又會(huì)被氧化重現(xiàn)籃色。 定糖 預(yù)備試驗(yàn)：吸取斐林試劑甲、乙液各 5 毫升，置入 250 毫升三角瓶中，加入 V1毫升試樣稀釋液 (含葡萄糖量約為 5~15 毫克 )及適量的 %標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，搖勻，以下同標(biāo)定時(shí)操作，總耗糖量為 V2 毫升。加 2 滴 1％次甲基藍(lán)溶液，繼續(xù)用水解糖液滴定至藍(lán)色消失，此滴定操作需在 1 分鐘內(nèi)完成。加 l00毫升 2%鹽酸溶液，輕輕搖動(dòng)三角瓶，使試樣充分濕潤(rùn)。 15H2O)，用水溶解并稀釋至 1000 毫升，如有不溶物可用濾紙過(guò)濾。對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中的水分快速測(cè)定，可采用更高溫度下干燥 (如 120140℃ )或紅外燈下干燥，以縮短分析時(shí)間。 水分測(cè)定方法一般采用烘干法，即在 100105℃烘箱中直接干燥。直至碘液呈純黃色，不變色，糖化結(jié)束； 在 10~15 分鐘內(nèi)急速冷卻到室溫； 沖洗攪拌器，擦干糖化杯外壁，加水使其內(nèi)容物準(zhǔn)確稱(chēng)量為 450 克； 用玻棒攪動(dòng)糖化杯，并注于漏斗中進(jìn)行過(guò)濾； 收集約 100 ml 濾液后，將濾液返回重濾。 所得結(jié)果表示至一位小數(shù)。 P) 或 %(m/m)表示。 或用儀器法直接自動(dòng)測(cè)定、計(jì)算、打印出樣品的真正濃度及原麥汁濃度。 (注意 保存蒸餾后的殘液，供做真正濃度用 )。 )℃的恒溫水浴中，待內(nèi)容物溫度達(dá) 20℃，并保持 5min不變后取出。 6 允許差 同一試樣兩次測(cè)定值之差，不得超過(guò)平均值的 4％。 4 分析步驟 試樣的處理：取試樣（ ）約 60mL 于 100mL 燒杯中，置于 (40177。 5 分析結(jié)果的表述 試樣中雙乙酰含量按式 (2)計(jì)算： ??AX ???????????????????????(2) 式中： X —— 試樣中雙乙酰的含量， mg/L ； A335 —— 試樣在 335nm波長(zhǎng)下，用 20mm比色皿測(cè)得的吸光度； —— 吸光度與雙乙酰含量的換算系數(shù)。 2 儀器 帶有加熱套管的雙乙酰蒸餾器 ； 具有錐形瓶 (或平底蒸餾燒瓶 )的蒸汽發(fā)生瓶： 2020mL(或 3000mL) ； 容量瓶： 25 mL ； 紫外分光光度計(jì)：備有 10mm石英比色皿或 20mm玻璃比色皿。 計(jì)算 游離的α 氨基氮（毫克 /升麥芽汁） =2179。 b 稀釋溶液： 2 克碘酸鉀溶于 600ml 水中，再加入 96%乙醇 400ml. c 標(biāo)準(zhǔn)溶液：溶 甘氨酸于 100ml 水中， 0℃貯藏。 5 操作步驟 （ 1）取糖化試驗(yàn)的麥芽汁，稀釋至 20 倍或更合適的倍數(shù)，使其滴定量在 15～50ml 之間。待碘化鉀溶解后，于暗處放置 10min，加 250ml 水，用 N 硫代硫酸鈉溶液滴定，近終點(diǎn)時(shí)加 3ml %淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至溶液由藍(lán)色轉(zhuǎn)變成亮藍(lán)綠色。另外的方法是將廢棄物直接放入下水道，而付給污水處理廠(chǎng)一定的費(fèi)用；或廠(chǎng)內(nèi)自行處理。 但必需為這些處理付出代價(jià)以保證環(huán)境只受到最少的污染。 第十三節(jié) 水的消耗和重復(fù)利用 許多發(fā)酵工廠(chǎng)的 水的消耗量很大（見(jiàn)下表）。 使用大型轉(zhuǎn)鼓式過(guò)濾機(jī)或離心機(jī)的工廠(chǎng)，其折舊、投資的回收和維修費(fèi)用共占總成本 80%以上。 在抗生素和其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)中，提取和收集產(chǎn)品階段的費(fèi)用將成為生產(chǎn)成本中的主要部分。對(duì)分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵的生產(chǎn)能力可利用 Wang 等的公式作出比較。生產(chǎn)能力還基于實(shí)驗(yàn)發(fā)酵時(shí)數(shù)，加上為下一批發(fā)酵所作的準(zhǔn)備時(shí)數(shù)。在瑞典的粗蛋白質(zhì)生產(chǎn)計(jì)劃，估計(jì)年產(chǎn) 10 萬(wàn)噸單細(xì)胞蛋白質(zhì)時(shí)，包括通氣攪拌在內(nèi)的公用系統(tǒng)費(fèi)用只占生產(chǎn)總成本的 16%（按 1978 年的價(jià)格計(jì)算）。他們引用一種抗生素發(fā)酵的例子，如將攪拌的電動(dòng)機(jī)從 745 焦耳放大到1860 焦耳以增加氧的傳遞速率，即可節(jié)約通氣攪拌費(fèi)用 25%。因而不再需要機(jī)械攪拌。按照通氣的情況，可以將發(fā)酵粗略地分為： 厭氧發(fā)酵，即在發(fā)酵時(shí)不宜有游離氧存在，如丁醇丙酮發(fā)酵； 發(fā)酵時(shí)只需要供應(yīng)少量氧氣，如乙醇發(fā)酵； 需氧發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)需要大量氧，如抗生素、乙酸和單細(xì)胞 蛋白質(zhì)發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程包括下列加熱和冷卻步驟： 將培養(yǎng)基加熱到 100℃和 100℃以上，然后冷卻到 35℃或更低； 將發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備加熱滅菌后再冷卻； 發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生熱量，必須將這些熱量輸出，即用冷卻處理，使溫度保持在微生物生長(zhǎng)的規(guī)定范圍之內(nèi)； 發(fā)酵結(jié)束后，還需加熱將產(chǎn)品中的水分除去。增加過(guò)濾器的截面積，勢(shì)必增加投資費(fèi)用，用低的操作成本，勢(shì)必使空氣的表觀速度和壓力下降。 Stark和 Pohler 發(fā)現(xiàn)可以利用壓縮空氣的熱量對(duì)空氣進(jìn)行滅菌。如在單細(xì)胞蛋白質(zhì)生產(chǎn)中，它只占制造成本的 414%。甜菜糖、蔗糖和谷物等碳水化合物是大多數(shù)培養(yǎng)基的主要碳源和能源。大量的含固體量較高的液體，如玉米漿和葡萄糖則需要保溫貯存以防止固化，但溫度又不能過(guò)高防止分解。 第六節(jié) 培養(yǎng)基 生產(chǎn)培養(yǎng)基的成本，在總成本中占很大比重，可達(dá) 3873%（見(jiàn)下表）。 對(duì)一個(gè)工廠(chǎng)的使用年限，可以規(guī)劃推算。發(fā)酒瘋的費(fèi)用占基本建設(shè)投資的 2025%。在 1979年 ICI 公司第一個(gè)供單細(xì)胞蛋白質(zhì)生產(chǎn)用發(fā)酵罐的容積為 1500M3，高 80M，價(jià)值 60 萬(wàn)英鎊。添置這類(lèi)設(shè)施，必定會(huì)增加成本，或干擾發(fā)酵罐內(nèi)的攪拌效果。在釀造業(yè)中的 n 值， Pratten 認(rèn)定為 。 要推斷一個(gè)化合物擁有市場(chǎng)的時(shí)間，即使有專(zhuān)利權(quán)的保護(hù)也是困難的。 1975 年巴西推行以蔗糖作底物生產(chǎn)乙醇的計(jì)劃，目 的是減少石油的進(jìn)口。例如：乙醇、正丁醇、丙酮、甘油和醋酸。 有許多公司，如 Cetus 公司， Panlab 公司都聘請(qǐng)有專(zhuān)門(mén)技能的專(zhuān)家主持菌種發(fā)展計(jì)劃，或改造菌種，使培養(yǎng)物適應(yīng)工業(yè)上的要求。利用誘變改良菌種，并結(jié)合培養(yǎng)基的改進(jìn)，明顯增加了青霉素的產(chǎn)量，它從 1940 年 100U/ml 上升到目前的 80000U/ml 左右。 對(duì)一個(gè)已知的微生