8第八章原位雜交組織化學(xué)(存儲版)
【正文】 ５ 4%多聚甲醛 PBS固定。 13 1 SSC， SSC， 37℃ 各漂洗 1030min。 21 20mmol/L EDTA， 。 ⑥ PBS洗 2 3min。 常用的免疫酶學(xué)檢測方法： DigHRP檢測系統(tǒng)： 以 DAB/H2O2為底物，結(jié)果為棕色； 以 4氯 1萘酚 / H2O2為底物，結(jié)果為藍色。 地高辛探針的應(yīng)用 基本操作步驟： 1）組織處理 冷凍切片： 切片貼在預(yù)先清潔、高溫處理并涂以粘附劑的載玻片上，先在 37℃ 預(yù)干燥 4h，然后置于 37℃ 烤箱中過夜。其他切片暫放于 PBS內(nèi)。 2）雜交 以含 cRNA探針（ ）的雜交液，按每張切片 1020ul的量覆蓋切片。定期卻出切片在顯微鏡下檢測反應(yīng)強度，根據(jù)反應(yīng)強度決定延長或終止反應(yīng)。 11:05:5911:05:5911:053/12/2023 11:05:59 AM 1以我獨沈久，愧君相見頻。 , March 12, 2023 很多事情努力了未必有結(jié)果，但是不努力卻什么改變也沒有。 上午 11時 5分 59秒 上午 11時 5分 11:05: 楊柳散和風(fēng)，青山澹吾慮。 2023年 3月 上午 11時 5分 :05March 12, 2023 1業(yè)余生活要有意義，不要越軌。 :05:5911:05:59March 12, 2023 1意志堅強的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 2023年 3月 上午 11時 5分 :05March 12, 2023 1少年十五二十時，步行奪得胡馬騎。 2023年 3月 12日星期日 11時 5分 59秒 11:05:5912 March 2023 1做前，能夠環(huán)視四周；做時，你只能或者最好沿著以腳為起點的射線向前。 靜夜四無鄰，荒居舊業(yè)貧。 ⑤ 浸入 BCIP/NBT中，室溫孵育 10～ 30min（或更長時間，視需要而定）。 ⑦ 浸入新鮮配制的 %乙酸酐以封閉非特異性結(jié)合部位。 ① PBS洗 2 3min。與生物素標記探針相比，地高 辛探針不受組織、細胞中內(nèi)源性生物素的干擾，敏感性高。通過隨即引物或缺口平移法，將 Dig11dUTP與探針的核酸分子相連，構(gòu)成 Dig配基標記的核酸探針。 ④ PBS洗 2 3min。 19 緩沖液 Ⅱ 洗 2 5min。 11 4 SSC洗脫蓋片，并在同一液中， 37℃ 漂洗 1030min。 ３ %Trixtion X100 PBS洗 15min。而直接標記的信號放大一般受到限制，目前多用 Dupon公司的 TSA系統(tǒng)進行直接標記信號的放大。事先與特異性的 cRNA或 cDNA進行雜交。干燥的切片即使大量的溶液 漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強了背景染色。大約有 70%～ 90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，可導(dǎo)致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。因此，在雜交液中加入鹽和 甲酰胺 ，減低 Tm。 雜交液的量要適當 : 以 10～ 20μl/ 每張切片為宜。 3 雜交（ Hybridisation） 雜交 :核酸探針進入細胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。如冰箱溫度恒定，在 70℃ 可保存數(shù)月之久不會影響雜交結(jié)果。 二 原位雜交組織化學(xué)基本技術(shù) ? 原位雜交的基本方法和應(yīng)用原則： ① 雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等； ② 雜交； ③ 雜交后處理； ④ 顯示（ visualization）： 放射性自顯影顯色、非放射性標記顯色 （一）原位雜交的基本要求 1 固定 2 玻片和組織切片的處理 3 雜交 4 雜交后處理 5 顯示 6 對照實驗和 ISHH結(jié)果的判斷 1 固定 固定劑的應(yīng)用和選擇原則： ① 保持細胞結(jié)構(gòu)； ② 最大限度地保持細胞內(nèi) DNA或 RNA水平； ③ 使探針易于進入細胞或組織 。 特點： 雜交在載玻片上的細胞進行。 ? 固定劑： 多聚甲醛、醋酸 酒精混合液、 Bouin’ s固定劑、 Carnoy’ s液 優(yōu)缺點： 沉淀性固定劑： 酒精 /醋酸混合液、 Bouin’ s液、 Carnoy’ s液 能增加核酸探針的穿透性，但不能最大限度地保存 RNA， 且對組織結(jié)構(gòu)有損傷。 ? 冷凍切片 —— 應(yīng)用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。 （ 4）防止 RNA酶的污染 ① 在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。 加蓋片的目的 防止孵育過程中的高溫（ 50
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