【正文】 酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶使膜損傷，原生質(zhì)體破裂、失活，再生率急劇降低。 Ca2*等強(qiáng)烈地促進(jìn)脂質(zhì)分子的擾動(dòng)和重新組合，使接觸處的膜形成小區(qū)域的融合，產(chǎn)生小的原生質(zhì)橋并逐漸增大，直至兩個(gè)原生質(zhì)體融合。因此，要獲得真正的融合子，必須在融合原生質(zhì)體再生后，進(jìn)行幾代自然分離和選擇，才能加以確定。 一、基因工程的基本操作 ? （一）、目的基因的取得： ? ①選擇適宜的給體細(xì)胞，從中采集分離有生產(chǎn)意義的目的基因； ? ②通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶的作用由 mRNA合成cDNA(互補(bǔ) DNA)； ? ③ 用化學(xué)方法合成特定功能的基因。使用最廣泛的是。經(jīng)過(guò)兩級(jí)克隆，麥迪霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)生一種新的紫色化合物，是麥迪霉素與放線紫紅素的雜種化合物，為一種新的抗菌素 ,命名為 MederhodinA。 ? 要使菌種在生產(chǎn)中長(zhǎng)期保持優(yōu)良的生產(chǎn)性狀就必須設(shè)法減少菌種的退化和死亡，做好保藏工作。由于雜菌污染導(dǎo)致生產(chǎn)性狀下降也不是退化，通過(guò)采取對(duì)設(shè)備的清洗、維修、重新殺菌等一系列措施，加強(qiáng)無(wú)菌操作，可以避免雜菌的繼續(xù)污染。泡盛曲霉變異菌株糖化酶產(chǎn)生株在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上傳代酶產(chǎn)量降低極少，在麥汁酵母膏培養(yǎng)基上傳到第 10代，產(chǎn)酶能力降至 1/4。如棲土曲霉 ，培養(yǎng)溫度由 28～ 30℃提高到 30 ～ 34℃ 防止了產(chǎn)孢子能力的衰退。稀釋、單細(xì)胞分離等。若把砂土管放在低溫或抽氣后密封，效果更佳。 三、菌種保藏 ? （二）、國(guó)內(nèi)外菌種保藏部分情況： ? 我國(guó) 1979年 7月成立中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì) (CCCCM) ， 亞洲第一，有 14000余株各種微生物，三種保藏方法（斜面．凍干．液氮）下設(shè) 5個(gè)菌種保藏管理中心。 ? 美國(guó)“農(nóng)業(yè)研究服務(wù)部菌種收藏所” (ARS)設(shè)立“北方地區(qū)研究室” (NRRL)。經(jīng) 5年后，假定第1代 (原種 )的冷凍干燥保藏菌種已分發(fā)完畢，就再打開(kāi)一瓶液氮保藏原種。 ? 因重組形式 ? ? F＋ 、 F－ 、 Hfr和 F′菌株的異同，并圖示它們的相互關(guān)系。 三、菌種保藏 ? ATCC僅采用兩種最有效的方法，即保藏期 5～ 15年的冷凍干燥保藏法和 20年以上的液氮保藏法，以最大限度地減少傳代次數(shù)和避免菌種衰退。 ? 除了上述保藏中心外 ， 從事微生物研究并保藏有一定數(shù)量各類專業(yè)用微生物菌種的科研單位、大專院校還有近百所。 ? 真空冷凍干燥法 在低于 15℃ 下，快速將細(xì)胞凍結(jié)，并保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華致干。保藏時(shí)間一般不超過(guò) 3個(gè)月，到時(shí)必須進(jìn)行移接傳代，再放回冰箱。絲狀菌采用孢子移種避免菌絲傳代，交替使用分生孢子和子囊孢子傳代等也可防止退化。保藏所用的斜面培養(yǎng)基組成應(yīng)根據(jù)不同菌種的特性加以選擇。培養(yǎng)和保藏條件可以從多方面影響菌種的退化。不利環(huán)境往往加速突變型生產(chǎn)菌向野生型方向退化。我國(guó)青霉素 G?；傅漠a(chǎn)量可達(dá) 3000單位 /L以上。蘇氨酸工程菌在前蘇聯(lián)和日本都已用于工業(yè)生產(chǎn) ,蘇氨酸產(chǎn)量可達(dá) 60g/L以上，我國(guó)蘇氨酸產(chǎn)量可達(dá) 20g/L 。由于每一種限制性內(nèi)切酶所切斷的雙鏈 DNA片段和粘性未端有相同的核苷酸組分，所以當(dāng)兩者相混時(shí)，凡粘性末端上堿基互補(bǔ)的片段，就會(huì)因氫鍵的作用而彼此吸引，重新形成雙鏈，這時(shí)，在外加連接酶的作用下，供體的 DNA片段與質(zhì)粒 DNA片段的裂口處被“縫合”，形成一個(gè)完整的有復(fù)制能力的環(huán)狀重組體 ——嵌合體。 ? 基因工程屬于狹義的遺傳工程，習(xí)慣上所說(shuō)的遺傳工程多指基因工程。 二、原生質(zhì)體融合育種 ? 選擇融合子 質(zhì)體融合可以是真正融合（雜合二倍體或單倍重組體）；或是暫時(shí)融合（異核體 ） 。 ? 研究發(fā)現(xiàn)，融合開(kāi)始時(shí)，強(qiáng)烈脫水引起質(zhì)體粘合，不同程度地形成聚集場(chǎng)，質(zhì)體收縮并高度變形，大量粘著的質(zhì)體形成非常緊密的接觸。一般酶解溫度 20～ 40 ℃ 。在細(xì)菌中加入 EDTA、 甘氨酸、青霉素和 D環(huán)絲氨酸等；在放線菌的中加入 1%～ 4%的甘氨酸等；在酵母菌中加入EDTA和巰基乙醇等；在粟酒裂殖酵母中加入 2脫氧葡萄糖等。 二、原生質(zhì)體融合育種 ? 篩選標(biāo)記菌株 親株常采用常規(guī)誘變育種方法，獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷和抗藥性等遺傳性狀為標(biāo)記。凡在高誘變率的基礎(chǔ)上既能擴(kuò)大變異幅度，又能促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量 。只有經(jīng)過(guò) DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，表型才會(huì)發(fā)生變異，出現(xiàn)不純菌落，稱為“表型延遲”。過(guò)程十分緩慢， “ 守株待兔 ” 。 雙倍體雜合子性狀極不穩(wěn)定 ,在其進(jìn)行有絲分裂過(guò)程中 ,其中極少數(shù)核中的染色體會(huì)發(fā)生交換和單倍體化 ,從而形成了極個(gè)別具有新性狀的單倍體雜合子。雙倍體細(xì)胞和單倍體細(xì)胞有很大不同 ,易于識(shí)別。因此 ，Hfr與 F接合的結(jié)果重組頻率雖高 ， 但卻很少出現(xiàn) F+的菌株，大多數(shù)情況下，仍是 F 。該菌株稱為初生 F′菌株。 研究細(xì)菌接合方法的基本原理 （一）原核微生物基因重組 ? 大腸桿菌 F因子 (即致育因子或性質(zhì)粒 )： ? 獨(dú)立于染色體外的小型的環(huán)狀 DNA， 一般呈超螺旋狀態(tài)，具有自主的與染色體進(jìn)行同步復(fù)制和轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞中去的能力。 ? 區(qū)別： 溫和噬菌體不攜帶供體菌基因； 噬菌體完整，沒(méi)有缺陷。該溶原菌因誘導(dǎo)而發(fā)生裂解時(shí)，有極少數(shù) (～ 105)的前噬菌體發(fā)生不正常切離，將插入位點(diǎn)兩側(cè)之一的少數(shù)宿主基因，連接到噬菌體DNA上，噬菌體也將相應(yīng)的一段 DNA遺留在宿主的染色體組上，通過(guò)衣殼的“誤包”，形成一種特殊的噬菌體 —（部分）缺陷噬菌體。 ? 受體菌進(jìn)行分裂時(shí)，只有一個(gè)子細(xì)胞獲得這段DNA，另一子細(xì)胞僅獲得供體基因的產(chǎn)物 —酶，在表型上出現(xiàn)供體菌的某一特征。 （一）原核微生物基因重組 ? A、 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)：噬菌體 本身 DNA沒(méi)有包進(jìn)去，形成缺陷型，同時(shí) 誤包供體菌中的任何基因 (包括質(zhì)粒 )， 使受體菌實(shí)現(xiàn)各種性狀的轉(zhuǎn)導(dǎo)。低濃度溶菌酶處理 ，提高細(xì)胞壁通透性 ， 可提高轉(zhuǎn)化頻率； （一）原核微生物基因重組 ? ④轉(zhuǎn)化：進(jìn)入的單鏈與受體菌染色體組上的同源區(qū)段配對(duì)，接著受體染色體組的相應(yīng)單鏈片段被切除，并被外來(lái)的單鏈 DNA所交換和取代，形成雜合 DNA區(qū)段 (它們間的 DNA順序不一定互補(bǔ)，故可呈雜合狀態(tài) )； ? ⑤復(fù)制：染色體組復(fù)制，雜合區(qū)段分離成兩個(gè)，其中之一類似供體菌，另一類似受體菌。堿基對(duì)發(fā)生自發(fā)突變的幾率約為 108～109。 （三）基因突變 機(jī)制 ? 自發(fā)（沒(méi)有人工參與所發(fā)生）突變機(jī)制： ? A、 背景輻射和環(huán)境因素的誘變：不少“自發(fā)突變”實(shí)質(zhì)上是一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素長(zhǎng)期綜合誘變導(dǎo)致。 ? 對(duì)休止細(xì)胞、游離噬菌體粒子或離體DNA分子不起作用 。 （三）基因突變 機(jī)制 ? 誘變機(jī)制：顯著提高突變頻率的理化因子，稱為誘變劑。 ? 稀有性 自變頻率低且穩(wěn)定 ，多為 106～ 109 。例如， 37℃ 下正常生長(zhǎng)，不能在 42℃ 下生長(zhǎng)等。 ? 按表型特征 ： ? 形態(tài)突變型：細(xì)胞或菌落形態(tài)改變。 四、原核生物的質(zhì)粒 ? （六）、降解性質(zhì)粒：可編碼降解復(fù)雜物質(zhì)的酶，利用一般細(xì)菌難以分解的物質(zhì)作碳源。約 4～ 8 104Da。 分子量為 107Da， （ 千堿基對(duì)），其中有 1/3的基因與接合作用有關(guān)。攜帶染色體上沒(méi)有的基因 ， 賦予某些特殊功能，例如接合、產(chǎn)毒、抗藥、固氮、產(chǎn)特殊酶或降解有毒物質(zhì)等。 ? 調(diào)節(jié)基因一般與操縱子有一定間隔距離 (一般小于 100個(gè)堿基 )，調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的活動(dòng)。相對(duì)分子量約為 105Da，10001500bp( 堿基對(duì) )，每個(gè)細(xì)菌一般含有 5， 000—10， 000個(gè)基因。 ? 將 32PDNA噬菌體、 35S蛋白質(zhì)外殼噬菌體分別感染無(wú)放射性的 ，攪拌離心，觀察。 ? 結(jié)果：①、②長(zhǎng)出 S菌；③、④、⑤、⑥只長(zhǎng) R菌。有許多不同菌株，有莢膜者具致病性，菌落表面光滑 ，稱 S型；有的不形成莢膜，無(wú)致病性，菌落外觀粗糙 ， 稱 R型。 一、基本概念 ? （三）、變異：在某種外因或內(nèi)因的作用下，生物體遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，即遺傳型的改變。 第八章 微生物的遺傳變異和育種 第一節(jié) 遺傳變異的概念及物質(zhì)基礎(chǔ) 第二節(jié) 基因突變與基因重組 第三節(jié) 微生物育種 第四節(jié) 基因工程 第五節(jié) 菌種保藏 第八章 微生物的遺傳變異和育種 ? 生物體最本質(zhì)的屬性之一。 ? 表型是一種現(xiàn)實(shí)性。 ? 肺炎鏈（雙）球菌 ， 球菌，成雙或成鏈，致人肺炎、小鼠敗血癥。 ? 將各組分逐個(gè)與活 R菌混合（①加 S菌的DNA； ② 加 S菌的 DNA及 DNA酶以外的酶；③加S菌的 DNA和 DNA酶 (分解 DNA)；④ 加 S菌的 RNA；⑤ 加 S菌的蛋白質(zhì)；⑥加 S菌的莢膜多糖），體外培養(yǎng)。 ? 以放射性 32PO34或 35SO24作為磷源或硫源培養(yǎng) ， 讓 T2噬菌體（只有核酸和蛋白質(zhì)）感染 ，獲得含 32PDNA核心的噬菌體或含 35S蛋白質(zhì)外殼的噬菌體。 ? （一）、細(xì)胞水平：核或核質(zhì)體 ? （ 二）、細(xì)胞核水平：核內(nèi)染色體 (核基因組 )，核外染色體（真核質(zhì)粒、質(zhì)體－線粒體、葉綠體；原核質(zhì)粒： F因子 性因子 、 R因子抗性因子 、 Col質(zhì)粒 產(chǎn)大腸桿菌素因子 、 Ti質(zhì)粒 誘癌 、巨大質(zhì)粒 固氮 、降解性質(zhì)粒 降解復(fù)雜物質(zhì) ） ? （三）、染色體水平 ： 數(shù)目，倍數(shù) ? （四）、核酸水平： DNA， RNA 三、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式 ? （五）、基因水平 ： 具有特定核苷酸順序的核酸片段，具有自主復(fù)制能力的最小遺傳功能單位。啟動(dòng)基因是轉(zhuǎn)錄起始部位。 ? 分子量一般在 106～ 108Da， 大小約為 1%核基因組。約等于 2%核染色體 DNA的小型 cccDNA。大腸桿菌素是 毒素，具有通過(guò)抑制復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或能量代謝等，專一地殺死其他腸道細(xì)菌的功能。 ? 根瘤菌屬中發(fā)現(xiàn)， 具有一系列固氮基因。 ? 染色體畸變： DNA的大段變化 (損傷 )，表現(xiàn)為插入 、 缺失 、 重復(fù) 、 易位和倒位。 ? A、 條件致死突變型：突變后，在某種條件下可正常生長(zhǎng)、繁殖并實(shí)現(xiàn)其表型，而在另一條件下卻無(wú)法生長(zhǎng)、繁殖。 ? 自發(fā)性 沒(méi)有人為誘變因素，自發(fā)產(chǎn)生。 實(shí)驗(yàn)證明，任何性狀既有正向突變，也可發(fā)生回復(fù)突變。如 5溴尿嘧啶 (5BU)、 5氨基尿嘧啶 (5AU)、 8氮鳥(niǎo)嘌呤 (8NG)、 2氨基嘌呤 (2AP)和 6氯嘌呤 (6CP)等。例如 ， 亞硝酸既能引起堿基對(duì)的轉(zhuǎn)換作用 ， 又能誘發(fā)染色體畸變 ； 一些電離輻射也可同時(shí)引起基因突變和染色體畸變。 （三）基因突變 機(jī)制 ? C、 互變異構(gòu)效應(yīng)： DNA鏈中， T以烯醇式出現(xiàn)，復(fù)制時(shí)，其相對(duì)位置不再是 A，而是 G； C以亞氨基形式出現(xiàn)，就和 A配對(duì)，使基因發(fā)生突變，造成自發(fā)突變。分子量＜ 5 105的 DNA片段不能進(jìn)入細(xì)胞。大腸桿菌、芽孢桿菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬、