【正文】 OQ(非 LOD) —— 回歸方程的截距應(yīng)接近于零 —— 相關(guān)系數(shù)要求 ?≥(色譜法 )或 ≥(生物學(xué)方法 ) —— 若非線性 ， 可分為高低 兩個濃度區(qū)間 (每個區(qū)間不少于 5個濃度 )， 分別加權(quán)回歸 —— 如 20和 50、 100、 200 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 41 體內(nèi)藥物分析 三、準(zhǔn)確度 方法準(zhǔn)確度 (accuracy) —— 系指用該方法 測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃度的接近程度 —— 應(yīng)使用實際生物樣品測定 ， 但實際生物樣品的濃度是未知的所以 ， 通常使用模擬生物樣品測定 —— 一般用 相對回收率 (relative recovery， RR) 或 相對誤差(relative error， RE)表示 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 42 體內(nèi)藥物分析 1. 測定法 取空白生物基質(zhì) （ 如血漿 ） 數(shù)份 ， 照標(biāo)準(zhǔn)曲線項下方法操作 ，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算 在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)制備質(zhì)控 (quality control， QC)樣品 —— 高 (接近上限 )、 中 、 低 (接近 LOQ) 3個濃度 —— 每一濃度至少 5個樣本 —— 與隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線同法測定 、 計算 ， 每個樣品分析測定 1次 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 43 體內(nèi)藥物分析 2. 結(jié)果計算與限度要求 計算 —— 測定值 M (measured)平均值與理論濃度 (加入值 )A(added)比值 相對回收率 相對誤差 限度要求 —— 相對回收率應(yīng)在 85%～ 115% (LOQ附近 80%～ 120%) —— RE在 177。 擬定方法結(jié)果為縱坐標(biāo) (Y) 用最小二乘法計算回歸方程 Y＝ a＋ bX (坐標(biāo)標(biāo)度相等 ) 相關(guān)系數(shù) (r)——表示兩種方法測得結(jié)果的一致性 —— 若 r ≠1， 表示擬定方法為非線性 ， 如 RIA 中抗血清滴度選擇不當(dāng) 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 30 體內(nèi)藥物分析 4. 與參比方法的相關(guān)性 Y＝ a＋ bX 截距 (a) —— 表示擬定方法受到 恒定干擾 的程度 —— 內(nèi)源性物質(zhì) (UV) 斜率 (b) —— 表示擬定方法受到 比例干擾 的程度 —— 標(biāo)記抗原不純 (RIA) 與參比方法的相關(guān)性比較 —— 除顯示分析方法的特異性外 —— 斜率 b表示兩種方法測得結(jié)果的一致性 若參比方法準(zhǔn)確度良好 —— 若截距 a≈0, 則擬定方法的準(zhǔn)確度 (回收率 )為 100b(%) 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 31 體內(nèi)藥物分析 二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 標(biāo)準(zhǔn)曲線 （ standard curve） —— calibration curve or working curve —— 生物樣品中所測定藥物濃度與響應(yīng)的 相關(guān)性 （ 比例的程度 ） —— 通常用回歸分析方法所得的 回歸方程 來評價 —— 除少數(shù)方法 （ 免疫分析法 ） 外 ， 標(biāo)準(zhǔn)曲線通常為 線性模式 —— 回歸分析法為 最小二乘法 （ least squares） 或 加權(quán)最小二乘法 （ weighted least squares） 線性范圍 （ linear rang） —— 標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高與最低濃度的區(qū)間 —— 模擬生物樣品的測定結(jié)果應(yīng)達到試驗要求的精密度和準(zhǔn)確度 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 32 體內(nèi)藥物分析 二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 (續(xù) ) 標(biāo)準(zhǔn)曲線 —— 用 模擬生物樣品 建立 —— 線性范圍 (不包括零點 )應(yīng)能覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度 —— 不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線所使用的模擬生物樣品 —— 應(yīng)使用與待測的含藥生物樣品相同的生物基質(zhì)制備 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 33 體內(nèi)藥物分析 標(biāo)準(zhǔn)曲線的一般建立方法 1. 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液 (非生物基質(zhì)溶液 )的制備 溶劑 —— 水或甲醇 （ 或其他適當(dāng)溶劑 ） 濃度 —— 標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品中藥物濃度的 50倍以上 加入量為生物樣品總體積的 2%以下 避免標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品與實際樣品存在較大差異 濃度較低 —— 應(yīng) 除去溶劑 后再加入生物基質(zhì) 否則 ,在實際樣品測定時應(yīng)加入等體積的溶劑并渦旋混勻 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 34 體內(nèi)藥物分析 2. 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度范圍 至少含 5～ 8個濃度點 (不包括零點 ,即空白 ) —— 可 覆蓋全部待測生物樣品中的藥物濃度 如： 50、 100(等比梯度模式 — 比例常數(shù)約為 2) 若體內(nèi)平均達峰濃度為 50， 其 1/20為 設(shè)定最高濃度為 100， 最低濃度為 1 (個體差異 ) 實際制備時： 500、 250、 100、 50、 10 …… 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 35 體內(nèi)藥物分析 3. 標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備 空白生物基質(zhì) (如血漿 )—— 加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液適量 ， 渦旋混勻 為防止在標(biāo)準(zhǔn)溶液加入及渦旋混合時造成的損失 —— ① 先加入標(biāo)準(zhǔn)溶液 ③ ② 再加入空白生物基質(zhì) ③ 渦旋混勻 ① ② 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 36 體內(nèi)藥物分析 4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以待測藥物的檢測響應(yīng) (如色譜峰面積或峰高 ) 或與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的檢測響應(yīng)的比值 (內(nèi)標(biāo)法 )(因變量 , y )對模擬血藥濃度 (自變量 ,x) —— 求得回歸方程 ( y＝ a＋ bx )及其相關(guān)系數(shù) ( ? ) 在一組由至少 7個濃度 (不包括零點 )構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)曲線中 ， 至多可有 2個濃度點數(shù)據(jù) ， 可予剔除 。i ii y yy? ? 2)39。 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 49 體內(nèi)藥物分析 五、定量限 方法定量限 (limit of quantitation， LOQ) —— 系指在保證具有一定可靠性 (準(zhǔn)確度與精密度符合要求 )的前提下 ， 能測定出生物樣品中藥物的最低濃度 —— 又稱為方法靈敏度 (sensitivity) —— 標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點 (最低濃度點 ≥LOQ) 要求 —— 應(yīng)能滿足測定 3～ 5個消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度 —— 準(zhǔn)確度在 80%～ 120%(或 RE在 177。 R2=(C=～ ?g/ml) 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 65 體內(nèi)藥物分析 四、分析方法驗證 (續(xù) ) 3． 方法精密度與準(zhǔn)確度 QC樣品 —— 濃度為 、 和 ?g/ml 分析批次 —— 3批 ， 每批 5 樣品 測得濃度 —— 、 和 ?g/ml 準(zhǔn)確度 RE(%) —— %、 % 和 % 精密度 批內(nèi) (%)—— %、 % 和 % 批間 (%)—— %、 % 和 % 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 X表 42 血漿中環(huán)丙沙星 HPLC測定法的準(zhǔn)確度與精密度考察結(jié)果 分析批次 加入量（ ng/ml） 2023 1 2 3 N 18 18 18 （ ng/ml） SD RE（ %） 批內(nèi) RSD（ %） 批間 RSD（ %） 表 血漿中環(huán)丙沙星 測定法的準(zhǔn)確度與精密度考察結(jié)果分析批次加入量（ ）（ ）（ ）批內(nèi) （ ）批間 （ ）3/5/2023 66 體內(nèi)藥物分析 四、分析方法驗證 (續(xù) ) 4． 方法定量限 受試制劑和參比制劑的 Cmax分別為 —— ? ? ?g/ml 方法的 LOQ為 ?g/ml＜