【正文】 ，短刺小克銀漢霉 (Cunninghamella blakesleana AS )與人體藥 物代謝的結(jié)果都比較一致，是研究藥物 CN鍵和 CO鍵斷裂較理想的體外 模型，還可以進(jìn)行相關(guān)的代謝產(chǎn)物的藥理活性實(shí)驗(yàn)。 第四章 新技術(shù)在微生物轉(zhuǎn)化的中 應(yīng)用 ? 隨著現(xiàn)代生物科學(xué)和生物技術(shù)的迅速發(fā)展，以及一些分析測(cè)試技術(shù)的應(yīng)用，微生物轉(zhuǎn)化也得到了進(jìn)一步的發(fā)展。目前在這方面的研究也是微生物轉(zhuǎn)化的一個(gè)趨勢(shì)，并且具有廣闊前景。 ? 這是由于生物產(chǎn)品如蛋白質(zhì)和酶往往是胞內(nèi)產(chǎn)品，需要經(jīng)細(xì)胞破碎后才能提取、純化，細(xì)胞顆粒尺寸的變化給固一液分離帶來(lái)了困難，另外這些產(chǎn)品的活性和功能對(duì) pH值、溫度和離子強(qiáng)度等環(huán)境特別敏感． 為了克服這些缺點(diǎn)．出現(xiàn)了雙水相技術(shù)。因?yàn)槌暡ǖ牟ㄩL(zhǎng)很短，所以具有很強(qiáng)的定向傳播能力。 ? 這一過(guò)程主要發(fā)生于固液兩相界面及細(xì)胞壁、細(xì)胞膜附近的區(qū)域。包括有機(jī)介質(zhì) (水不溶性 )發(fā)酵液和有機(jī)介質(zhì) (水不溶性 )緩沖液兩種類(lèi)型。 ? 例如丙烯腈通過(guò)棒狀桿菌轉(zhuǎn)化為丙烯酰胺的過(guò)程中，先后對(duì)攪拌式反應(yīng)器、填充式反應(yīng)器、密集多相流反應(yīng)器以及膜反應(yīng)器的應(yīng)用進(jìn)行研究。 ? 總之，微生物轉(zhuǎn)化是微生物學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)、遺傳工程、過(guò)程工程科學(xué)等學(xué)科的 交叉領(lǐng)域，其目標(biāo)就是 通過(guò)采用微生物生產(chǎn)人類(lèi)所需要的化學(xué)品、醫(yī)藥、能源等。 ? 至今，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從雷公藤屬植物中分離出幾十種化學(xué)成分，主要為生物堿類(lèi)、二萜類(lèi)、三萜類(lèi)、倍半萜類(lèi)、糖和木質(zhì)素類(lèi)。 第二節(jié) 鬼臼毒素 一、概述 ? 鬼臼毒素 (podophyllotoxin)是從小檗科植物喜馬拉雅鬼臼 (Podophyllum emodi)和美洲鬼臼(Podophyllum peltatum)的根莖中分離得到的木脂素類(lèi)化合物。 ? 鬼臼毒素為無(wú)色針狀結(jié)晶，分子式為C22H22O8，相對(duì)分子質(zhì)量 414，熔點(diǎn) 112～117℃ ，溶于乙醇、氯仿、丙酮、熱苯和冰醋酸。 1997年他在Bioanic Medicinal Chemistry Letters報(bào)道化合物 119，到化合物 120運(yùn)用面包酵母 (Baker′s yeast)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化 迄今未見(jiàn)用生物轉(zhuǎn)化報(bào)道的步驟： ? 由化合物 118到化合物 119是一個(gè)氧化反應(yīng)，因此可以選擇具有氧化脫氫酶體系的微生物進(jìn)行此反應(yīng)。篩選了２１種微生物對(duì)大黃酚 (154)、大黃素甲醚 (155)、大黃素 (156)的轉(zhuǎn)化作用進(jìn)行了研究。 第四節(jié) 麻黃堿 ? 麻黃堿 (ephedrine)又稱(chēng)麻黃素，其差向異構(gòu)體 l麻黃堿和 d偽麻黃堿是著名中藥麻黃的主要活性成分，都是多功能多用途藥物，在臨床上有廣泛的應(yīng)用。其芐位羥基經(jīng)乙?；土u基取代可以產(chǎn)生構(gòu)型轉(zhuǎn)化得到 (1S， 2S)2甲氨基 1苯基丙醇，即 D麻黃堿 (pseudorephedrine)，具有減輕充血作用 , 能與抗組胺藥配伍制成抗感冒和抗過(guò)敏藥物。 ２．直接化學(xué)合成法 ? 麻黃堿的生產(chǎn)也有直接化學(xué)合成的報(bào)道，但是產(chǎn)生的是 dl麻黃堿和 dl偽麻黃堿的外消旋體，需要進(jìn)一步拆分，成本較高。 ? 初步認(rèn)為這種蒽醌的糖苷化酶是胞內(nèi)酶 (即存在于微生物的細(xì)胞內(nèi) )。味苦性寒，為瀉下、健胃、清熱、解毒中藥 . ? 大黃富含的大黃素 (emodin)、大黃酸(rhein)、大黃酚 (chrysophanol)、大黃素甲醚 (physcion)、蘆薈大黃素 (aloeemodin)等蒽醌類(lèi)化合物，是重要的致瀉和抗菌作用活性成分。 ? 印度學(xué)者 Ahmed Kamal在 Tetrahedron Letters發(fā)表文章，介紹了他們的研究進(jìn)展。 ? 為了尋找活性高和毒副作用低的鬼臼毒素衍生物，近年來(lái)對(duì)鬼臼毒素的改造和生理活性的篩選工作仍在進(jìn)行當(dāng)中，其中有代表性的新藥是 NPF和 GL331。 ? 以上對(duì)兩種雷公藤內(nèi)酯的生物轉(zhuǎn)化共得到 1 7個(gè)產(chǎn)物，其中 11個(gè)為新化合物。 ? 雷公藤是我國(guó)近年來(lái)開(kāi)發(fā)的一種新的藥物資源，臨床上已被應(yīng)用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、麻風(fēng)病、自身免疫性疾病和皮膚病。 七、核磁共振、質(zhì)譜技術(shù)在微生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用 ? 隨著分析測(cè)試技術(shù)的迅速發(fā)展，核磁共振、質(zhì)譜等在微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中也得到了廣泛的運(yùn)用。 ? 例： Smolders等利用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌在磷脂、苯和少量水組成的微乳液中進(jìn)行 16甲基 萊氏化合物 S21醋酸酯 C1， 2位脫氫研究，經(jīng)過(guò)反應(yīng) 15h左右，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到 98％ (圖 1 13)。 ? 此外，由于一些底物或前體在水相中的溶解度很小，通過(guò)用有機(jī)相作為介質(zhì)可以大大提供其溶解度，即增加了底物或前體的加入濃度，在一定程度上也提高了轉(zhuǎn)化率。 ? 超聲波技術(shù)應(yīng)用于微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，主要是涉及固液傳質(zhì)的生物體系。 四、超聲波技術(shù)在微生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用 ? 超聲波是指頻率高于 2 104Hz的機(jī)械波。 ? Kaul等采用了海藻酸鹽固定化生物催化劑(簡(jiǎn)單節(jié)桿菌 )和底物 (氧化可的松 )進(jìn)行碳一位和二位脫氫反應(yīng)研究。 ? 如，應(yīng)用 DNA重組技術(shù)建立了絲氨酸和色氨酸合成酶工程菌，這種工程菌組裝的生物反應(yīng)器可以用甘氨酸和甲醛為原料制造絲氨酸，反應(yīng)液含絲氨酸超過(guò) 400g／ L，再?gòu)慕z氨酸與吲哚轉(zhuǎn)化生成色氨酸，反應(yīng)液中色氨酸濃度達(dá)到 200g／ L。 ? 從以上的實(shí)例可以進(jìn)一步看出微生物轉(zhuǎn)化可以作為研究藥物體內(nèi)代謝的一個(gè)重要工具。在轉(zhuǎn)化液中檢測(cè)到維拉帕米 主要形成 C N鍵和 C O鍵斷裂的 10種氧化代謝產(chǎn)物，其中 N去短鏈烷基維拉帕米為主要產(chǎn)物 ，產(chǎn)率大于 65％，其他代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率均小于 15%。 ? 基于這一理論． Foster等研究發(fā)現(xiàn)Cunninghamella bainieri對(duì)普羅帕酮以及甲氧那明的生物轉(zhuǎn)化，與人體內(nèi)的代謝過(guò)程十分類(lèi)似，提示該菌具有與人體類(lèi)似的藥物代謝酶，并且可以用于藥物間相互作用的研究。 ? Ⅰ 相代謝反應(yīng)主要是官能團(tuán)化 (functionalization)，包括氧化、還原、水解等反應(yīng)。 ? 化學(xué)合成途往主要是化學(xué)家們依據(jù)理論、自身經(jīng)驗(yàn)及文獻(xiàn)報(bào)道，主觀地設(shè)計(jì)合成路線，因此在仿生性和立體結(jié)構(gòu)選擇性方面存在一定的難度，甚至很難實(shí)現(xiàn)； ? 相反生物體經(jīng)長(zhǎng)期的演化進(jìn)化，具有一套自身特異性的酶體系，使得生物轉(zhuǎn)化合成物質(zhì)的途徑處于最佳狀態(tài)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，人們運(yùn)用基因工程法構(gòu)建一種新的工程菌．它能直接將葡萄糖轉(zhuǎn)化為 2酮基 L古龍酸。因此它們的合成研究備受人們關(guān)注，除了傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法外，現(xiàn)在越來(lái)越多人也重視其微生物轉(zhuǎn)化合成法。 表 12三種手性化技術(shù)方法的比較 ? 微生物轉(zhuǎn)化在合成手性化合物領(lǐng)域已經(jīng)廣泛運(yùn)用。 ? 如用于消除孕婦早期妊娠反應(yīng)的鎮(zhèn)靜劑 “反應(yīng)停 ” (thalidomide，沙利度胺 )被應(yīng)用不久，就被發(fā)現(xiàn)可以致使嬰兒出現(xiàn)畸形，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn) 具有鎮(zhèn)靜作用的是其 R一對(duì)映體．而致畸變是由 s一對(duì)映體引起的 。 ? 按照 1961年國(guó)際生化會(huì)議的規(guī)定，根據(jù)酶催化的反應(yīng)類(lèi)型不同，酶可以分為六大類(lèi)：①氧化還原酶類(lèi)；②轉(zhuǎn)移酶類(lèi)； ③水解酶類(lèi)；④裂合酶類(lèi)；⑤異構(gòu)酶類(lèi)； ⑥合成酶 (連接酶 )類(lèi)。 ? 在微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中許多重要的酶在沒(méi)有誘導(dǎo)的情況下是檢測(cè)不到其酶活的，這類(lèi)酶稱(chēng)為誘導(dǎo)酶。 ? 一般操作方法是先配制好表面活性荊質(zhì)量濃度為 3％的轉(zhuǎn)化液，然后將不溶水的粉末狀底物滴加分散到轉(zhuǎn)化液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，必要時(shí)可用超聲波促進(jìn)分散程度。 ? 加底物速度和量要與微生物的耐受能力相掛鉤，底物舔加的速度和總量不能超過(guò)微生物的耐受范圍， ? 同時(shí)產(chǎn)物的積累也會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生抑制，所以必須有一個(gè)合適的底物添加量， 一般來(lái)說(shuō)，非離子化合物的底物最大投料質(zhì)量濃度約為 10 ％ ，而離子型的底物為 5％； 不同 的微生物對(duì)有毒性的底物的耐受性不一致，一般來(lái)說(shuō)在微生物生長(zhǎng)期其耐受有毒底物的能力比較低； 還得注意的一點(diǎn)是即使對(duì)沒(méi)有毒性的底物，當(dāng)轉(zhuǎn)化積累到大量的非毒性底物時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，所以最好用連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵隨時(shí)分離轉(zhuǎn)化得到的產(chǎn)物。 ? 既然是酶反應(yīng)，就存在一個(gè)最佳的反應(yīng)時(shí)間，時(shí)間太短則轉(zhuǎn)化不完全；時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)造成微生物衰亡及酶失活。 ? 特別是生理活性很高的激素、抗生素以及心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等藥物的藥效對(duì)對(duì)映體結(jié)構(gòu)的要求很高，往往具有嚴(yán)格對(duì)映體結(jié)構(gòu)要求，這是有機(jī)化學(xué)合成等方法根難達(dá)到的。 ? ④ 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)是酶催化的反應(yīng)。 ? ① 冰凍干燥法 ：將培養(yǎng)好的菌絲液，通過(guò)離心或過(guò)濾，洗滌后獲得干凈的菌絲體并重新懸浮于稀的緩沖液或純水中，冰凍后抽真空，直接升華除去水分．得到蓬松的粉末。 應(yīng)用孢子進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化 ? 細(xì)菌的孢子一般無(wú)活性，而真菌的分生孢子和子囊孢子往往有較高的酶活力，與菌絲體比較具有雜質(zhì)相對(duì)少的優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)在將幾種微生物轉(zhuǎn)化方法簡(jiǎn)介如下。一般可以向國(guó)家或地方保管菌種機(jī)構(gòu)去函索取。 ? 利用微生物的作用來(lái)進(jìn)行某種化學(xué)反應(yīng)稱(chēng)為微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng) (microbial transformation or microbial bioconversion)。 ? ? 微生物轉(zhuǎn)化是通過(guò)微生物細(xì)胞將復(fù)雜的底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，也就是利用微生物謝過(guò)程中產(chǎn)生的某個(gè)或某一系列的酶對(duì)底物特定部位 (基團(tuán) )進(jìn)行的催化反應(yīng)。 ? 正因?yàn)槲⑸镉兄@獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)， 微生物轉(zhuǎn)化 就具備了生物量積累快、轉(zhuǎn)化時(shí)間短、轉(zhuǎn)化酶表達(dá)效率高、便于工業(yè)化生產(chǎn)的 特點(diǎn)。 第一節(jié) 微生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng) ? 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，特別是固定化細(xì)胞、誘變和基因重組等的發(fā)展，使微生物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率成倍提高，也為天然藥物結(jié)構(gòu)修飾帶來(lái)了廣大的發(fā)展空間。 4 添加刺激劑或抑制劑 ? 添加抑制劑是抑制酶副反應(yīng)或抑制其他反應(yīng)不良酶的生長(zhǎng)；添加刺激劑是提高酶活力和增加酶生長(zhǎng)量。 利用酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化 ? 直接從微生物體內(nèi)或發(fā)酵液中將酶提出．在體外對(duì)底物進(jìn)行生物催化。 應(yīng)用固定化細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化 ? 固定化細(xì)胞在適宜的轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化能保持細(xì)胞相對(duì)活的狀態(tài)，它的 最大優(yōu)點(diǎn)是 可以長(zhǎng)期反復(fù)使用，有的能維持有效催化達(dá)數(shù)月之久。 ? 丙酮干粉劑必須冰凍貯藏，以供隨時(shí)使用。 ? 如維生素 c生物合成中基因重組葡萄糖酸氧化桿菌的代謝工程菌，將 L山梨醇脫氫酶基因和 L山梨酮脫氫酶基因，通過(guò)基因重組構(gòu)建出一個(gè)工程菌株，發(fā)酵過(guò)程可以在同一次轉(zhuǎn)化發(fā)酵中將 D一山梨醇轉(zhuǎn)化成 α一酮一