使用rnascope技術(shù)探索hbvdnacccdna以及mrna在肝組織中的分布docxdocx(存儲(chǔ)版)
【正文】 目的三 對(duì)比IFN治療反應(yīng)不同病人之間各核酸表達(dá)與分布的不同Reference1. Seeger C, Mason WS (2000) Hepatitis B Virus Biology. Microbiology amp。圖六探針組1 與HBV 正義鏈（nt19302900）互補(bǔ)，可以和HBV DNA的正鏈以及pgRNA雜交探針組2 與HBV 負(fù)義鏈（nt2957837）互補(bǔ)，只和HBV DNA結(jié)合探針組3 對(duì)應(yīng)HBV 正鏈的缺失段（nt10901690），與HBVDNA負(fù)鏈互補(bǔ)，使用RNAse去除mRNA后可以專(zhuān)門(mén)用于檢測(cè)cccDNA。 D KH W 等[6]根據(jù)此原理 ,分別設(shè)計(jì)了與 HBV DR2區(qū)正鏈下游、負(fù)鏈上游相結(jié)合的兩種入侵探針 ,這樣當(dāng)正鏈、負(fù)鏈均為完整時(shí)產(chǎn)生兩種熒光信號(hào) ,從而檢測(cè) cccDNA 。(三) RealTime quantitative PCRHe等[3]建立了實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)cccDNA的方法。 13, 16, HBV CCC F3=HBV CCC R1。(一) Southern blotHBV cccDNA 以往多用 Southern blot 方法進(jìn)行檢測(cè) ,該方法是分子生物學(xué)的經(jīng)典方法 ,但對(duì)操作者的技術(shù)要求較高 ,且步驟繁瑣 ,靈敏度較低[4]。HBV基因組有部分單鏈，部分雙鏈，以及部分的三DNA鏈在病毒粒子中。本項(xiàng)目有助于我們進(jìn)一步了解HBV傳播的機(jī)制，為HBV的治療提供指導(dǎo)。依賴(lài)宿主細(xì)胞的 DNA 聚合酶補(bǔ)齊兩條鏈上的缺口 ,并進(jìn)一步折疊、扭曲形成超螺旋結(jié)構(gòu)的 cccDNA ,并以 cccDNA 為模板轉(zhuǎn)錄為不同大小的 mRNA ( 、 、 mRNA) ,從而翻譯各種病毒蛋白。2. 傳統(tǒng)HBV cccDNA 的常用檢測(cè)方法根據(jù)cccDNA與rcDNA在結(jié)構(gòu)和理化特性上的不同 ,可以建立檢測(cè) cccDNA 的方法 : (1) rcDNA能與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合 ,cccDNA 則不能。 2, 5, HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R2。 HBV_CCC_F2: 5’TGTTCACCAGCACCATGC3’。若負(fù)鏈含有缺口 ,由于上游引物引發(fā)的鏈延伸不能通過(guò)負(fù)鏈缺口 ,故不能產(chǎn)生熒光信號(hào)。圖四 入侵檢測(cè)技術(shù)原理示意圖圖五入侵檢查檢測(cè)cccDNA（五）最新型的RNAscope 技術(shù)RNAscope174。 Molecular Biology Reviews 64: 51.2. Addison WR, Walters KA, Wong WW, Wilson JS, Madej D, et al. (2002) HalfLife of the Duck Hepatitis B Virus Covalently Closed Cir
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