用基因芯片檢測單核苷酸多態(tài)性反應(yīng)原理(存儲版)
【正文】 的標(biāo)簽和固定在芯片上的互補的標(biāo)簽相結(jié)合，不同位點的目標(biāo)產(chǎn)物能夠在芯片上相分離。等位基因特異性寡核苷酸雜交反應(yīng)(allelespecific oligonucleotide hybridization, ASO)是利用固定在芯片上的寡核苷酸與標(biāo)記DNA靶標(biāo)的序列特異性雜交，其分辨原理基于單堿基錯配對DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，因此分辨率依賴于反應(yīng)中SNP位點前后的寡核苷酸序列和雜交反應(yīng)條件。其中最少的一種等位基因在群體中的頻率不小于1%。近幾年SNP芯片研究在反應(yīng)原理方面取得了重大進展，其中包括基于核酸雜交反應(yīng)的芯片、基于單堿基延伸反應(yīng)的芯片、基于等位基因特異性引物延伸反應(yīng)的芯片、基于“一步法”反應(yīng)的芯片、基于引物連接反應(yīng)的芯片、基于限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的芯片、基于蛋白DNA結(jié)合反應(yīng)的芯片，及基于熒光分子DNA結(jié)合反應(yīng)的芯片。目前已有多種方法可用于SNP檢測,傳統(tǒng)的SNP檢測方法是采用一些已有的成熟技術(shù),如DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformational polymorphism ,SSCP)、變性高效液相色譜(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)等。DNA多聚酶的特異性使該方法的敏感度和分辨率均較高，但其缺點是必須使用多色熒光系統(tǒng)以及相應(yīng)的檢測系統(tǒng)，而且多種染料的激發(fā)光和發(fā)射熒光的光譜往往會有較大部分的重疊，從而干擾對熒光強度的測量精度［3］。 (b): SBETAGS reaction等位基因特異性引物延伸(allelespecific primer elongation)也是依賴于DNA聚合酶的對錯配堿基的敏感性進行的［6］。其分辨原理基于由反轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的等位基因特異性引物沿著RNA靶標(biāo)延伸反應(yīng)的特異性。與樣品DNA完全匹配的探針能夠在連接酶的催化下與熒光探針連接而不被洗脫，從而檢測到熒光信號。但該方法的缺點是：(1)由于檢測基礎(chǔ)是錯配雜交，因此應(yīng)盡量采用雜交效率比較高的主動雜交芯片，如微電子芯片，這就大大限制了其應(yīng)用范圍；(2)各種類型的錯配堿基對與錯配結(jié)合蛋白的結(jié)合能力不同而引起了假陽性率的提高，使得用于判定SNP基因型的準則難以確定。藥物遺傳學(xué)是藥物基因組學(xué)研究內(nèi)容之一，其側(cè)重點是研究藥物反應(yīng)多態(tài)性的遺傳基礎(chǔ)以及將研究成果用于藥物開發(fā)和個性化治療。一串符號就是某個人的基因身份證［19］。%是相同的，但是每個人卻在各個方面表現(xiàn)得千差萬別，從本質(zhì)上說，%的差別造成的，這些差別即多態(tài)性。綜上所述，不同方法有其適用范圍和優(yōu)缺點，研究者應(yīng)根據(jù)不同的目的選取合適的方法，以達到最大的檢出效率和準確性。如果被檢測基因是一種可以被酶切的基因型，那么熒光標(biāo)記末端被切下洗脫，檢測不到熒光或者熒光較弱，反之則較強。Huber等［11］建立了將基因組DNA直接用于基因分型“一步法”芯片系統(tǒng)，所謂“一步法”，即將用于制備分型靶標(biāo)的多重擴增反應(yīng)和用于基因分型的等位基因特異性延伸反應(yīng)在芯片平臺上相結(jié)合，使兩者直接在芯片上的單個反應(yīng)步驟中完成。為了克服這一缺點，O’meara等［9］將三磷酸腺苷雙磷酸酶引入到等位基因特異性延伸反應(yīng)中以控制反應(yīng)特異性。 (d): Detection of fluorescence 2002年，Hirschhorn等［4］創(chuàng)建的SBETAGS法，原理如圖2所示，在芯片上進行單堿基延伸反應(yīng)時，使用了具有雙重功能的引物，即除了等位基因特異性的序列，還另有一段具有特定序列的標(biāo)簽(tag)。近年來隨著復(fù)雜性疾病研究的深入，以及可利用的基因組數(shù)據(jù)的增加, 基于各種原理的SNP芯片被開發(fā)出來，以適應(yīng)不同目的、規(guī)模和條件的基因分型。1SNP芯片技術(shù)簡介單核苷酸多態(tài)性是由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性,包括單個堿基的轉(zhuǎn)換、顛換以及單個堿基的缺失和插入。比較了上述各種芯片技術(shù)方法的優(yōu)劣，為進一步科研工作的開展提供了參照，并綜述了SNP芯片在疾病基因組學(xué)、藥物遺傳學(xué)和個體識別等科研領(lǐng)域的應(yīng)用，且對其今后的發(fā)展方向進行了闡述。這些技術(shù)雖在某種程度上能完成對SNP的檢測,但距快速、高效、自動化的目標(biāo)還相差甚遠。圖1單堿基延伸反應(yīng)（SBE）檢測SNP基因型(a): 寡核苷酸引物固定于芯片上； (b): 待測PCR產(chǎn)物與引物堿基配對；(c): DNA聚合酶作用下的單堿基延伸反應(yīng)；(d): 熒光種類的檢測Fig. 1SNP genotyping by single base extension(SBE)(a)：Oligonucleotide primers were immobilized on microarray。它的原理與SBE大致相同，但是引物的3′端為SNP位點，且用以擴增的是dNTP而非ddNTP
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