動物固體組織蛋白提取protocol(存儲版)
【正文】 ，組織蛋白酶D和凝乳酶。胰蛋白酶抑制劑(aprotinin)1)抑制絲氨酸蛋白酶，如血漿酶，血管舒緩素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。a2巨球蛋白廣譜1∪/ml100∪/ml PBS 溶液避免接觸還原劑Pefabloc SC(boe hringer Mannheim)絲氨酸蛋白酶100mM水溶液無毒，在中性pH下較PMSF 穩(wěn)定胃蛋白酶抑制劑酸性蛋白酶1mg/ml甲醇溶液原礬酸鈉需要經(jīng)過處理以后才能成為激活的礬酸鈉，激活的礬酸鈉才具有抑制去磷酸化的作用。磷酸酶抑制劑NaF氟化鈉 溶解性：溶于水分子量：使用：貯存液5M，工作濃度10~20mM。不含EDTAEDTA金屬蛋白酶500mmol/L水溶液pH=3)儲存液4℃穩(wěn)定一周，20℃穩(wěn)定6個(gè)月。4)工作濃度:~(~)。2)10mg/ml溶于異丙醇中。在蛋白質(zhì)提取過程中，需要加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白水解。6. 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強(qiáng)烈vortex使樣品裂解充分。裂解液用量說明：通常6孔板每孔細(xì)胞加入150微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200微升或250微升。按照6孔板每孔加入150250微升裂解液的比例加入裂解液。 4. 檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量。此法的缺點(diǎn)是：，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g—球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1234567Commsie法吸光值BCA法吸光值其中1到8為2000ug/ml，1000,500,250,125,濃度的BSA蛋白，9為空白孔，樣品1為8倍稀釋M231總蛋白，樣品2為32倍稀釋M231總蛋白Commassie法：為了測試準(zhǔn)確，應(yīng)在試劑加入后的5～20min內(nèi)測定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。（溶液A）至每孔混勻并充分震蕩30S，在室溫孵育樣品10min。博士德為大家提供兩種蛋白測定手段，每種都有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。注：應(yīng)現(xiàn)加蛋白樣本，再加工作液?？?0℃保存。手工勻漿：將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次（6～8分鐘），充分研碎，使組織勻漿化。動物固體組織蛋白提取 Protocol 前夜將磁珠及勻漿管洗凈置入75%乙醇中浸泡。b、勻漿。d、離心后EP管中液體分三層，提取中間無色液相，移入新的EP管中。d、取2025ul 10倍稀釋蛋白樣本加入96孔板平底板內(nèi)，再加入200ulAB工作液，混勻振蕩后，37℃ incubate 30min。在典型的蛋白測定中，化學(xué)試劑加入到蛋白樣品溶液里產(chǎn)生顏色變化，這一變化可由分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀檢測，并與已知濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較。，再用標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷出樣品的蛋白濃度。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、ED
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