【正文】 0提供。總之，植物必需營養(yǎng)元素可組成結(jié)構(gòu)物質(zhì)，也可是具有生理活性的物質(zhì)，如酶、輔酶以及作為酶的活化劑，參與活躍的新陳代謝。蔗糖使用濃度在2％～3％，常用3％，即配制1L培養(yǎng)基稱取30g蔗糖，％，但在胚培養(yǎng)時采用4％～15％的高濃度，因蔗糖對胚狀體的發(fā)育起重要作用。主要有Vsl(鹽酸硫胺素)、VD6(鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、VC(抗壞血酸)、有時還使用生物素、葉酸、VB2等。使用濃度一般為l00mg／L，適當使用肌醇，能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。它對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促進作用，但對器官的分化作用不明顯。用黃熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?。受酸和酶的作用易分解，使用時要注意。天然的生長素熱穩(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。2，4D (2，4二氯苯氧乙酸) 起動能力比IAA高10倍，特別在促進愈傷組織的形成上活力最高，但它強烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有70％～100％失效，應當采用過濾滅菌法加入。如為了促進芽器官的分化，應除去或降低生長素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細胞分裂素的比例。若濃度過低，凝固性不好。可在液體培養(yǎng)基表面安放一個無菌濾紙制成的濾紙橋，然后在濾紙橋上進行愈傷組織培養(yǎng)。值得提醒的是，在工作中不能以為有了抗菌素，而放松滅菌措施。8. 活性炭 (active carbon)活性炭為木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉沫結(jié)構(gòu)，它結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大，吸水力強，有很強的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。但是，活性炭具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附100ng左右的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，這說明只需要極少量的活性炭就可以完全吸附培養(yǎng)基中的調(diào)節(jié)物質(zhì)。而到60和70年代則大多采用MS等高濃度培養(yǎng)基，可以保證培養(yǎng)材料對營養(yǎng)的需要，并能生長快、分化快，且由于濃度高，在配制、消毒過程中某些成分有些出入，也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡。2．White培養(yǎng)基 是1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設計的。從實踐得知有些植物在B5培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。配制時注意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如Ca2+和S042，Ca2+，Mg2+和PO43一起溶解后，會產(chǎn)生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。（1）大量元素母液可配成濃度10倍母液。按表分別稱取藥品，溶解，混合后加水定容至500ml。2，4D可用少量1mol NaOH溶解后，再加水定容到一定濃度。(若用瓊脂粉，應加入100ml左右的液體培養(yǎng)基，并攪拌均勻)。但要根據(jù)培養(yǎng)對象來決定。然后蓋上鍋蓋，對角旋緊螺絲，接通電源加熱，打開放氣閥放氣，回“0”，后關閉放氣閥。包括植物體的各種器官、組織、細胞和原生質(zhì)等。依此觀點，無菌室等未處理的地方、超凈臺表面、簡單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。與此相關的一個概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以通過嚴格滅菌的操作空間(接種室、超凈臺、等)和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在0．1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121℃。到達保壓時間后，即可切斷電源，可緩慢放出蒸氣，應注意不要使壓力降低太快，以致引起激烈的減壓沸騰，使容器中的液體四溢。高壓滅菌前后的培養(yǎng)基，～。為防止高壓滅菌產(chǎn)生的上述一些變化可用下列方法(1) 經(jīng)常注意搜集有關高壓滅菌影響培養(yǎng)基成分的資料，以便及時采取有效措施。冷卻后，立即使用。干熱滅菌能源消耗太大，浪費時間。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關閉緊密即可。6. 一些物體表面用藥劑噴霧滅菌物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70％酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。在快到時間之前1～2min，開始把消毒液傾人一備好的大燒杯內(nèi)，要注意勿使材料倒出，傾凈后立即倒入無菌水，輕攪涮洗。（一）外植體的接種——無菌操作1．無菌操作接種時由于有一個敞口的過程，所以是極易引起污染的時期，這一時期主要由空氣中的細菌和工作人員本身引起，接種室要嚴格進行空間消毒。若連續(xù)接種，每5天要大強度滅菌一次。(3) 用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。并用棉塞，塞好后，包上包口紙，包口紙里面也要過火。即接種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時，只能采用頂芽、側(cè)芽或帶有芽的莖切段，其他如種子萌發(fā)后取枝條也可以。多數(shù)情況下它先形成芽，后形成根。用靠培養(yǎng)不定芽得到的培養(yǎng)物，一般采用芽叢進行繁殖，如非洲菊、草莓等。第二種，形成胚狀體，再發(fā)育成完整植株。③培養(yǎng)基成分 濃度過高的無機鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細胞分裂素的水平過高也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。④連續(xù)轉(zhuǎn)移 對容易褐變的材料可間隔1224h的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7lOd后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大為減輕。這種方法簡便易行，能保持母種特性。增殖使用的培養(yǎng)摹對于一種植物來說每次幾乎完全相同，由于培養(yǎng)物在接近最良好的環(huán)境條件，營養(yǎng)供應和激素調(diào)控下，排除了其他生物的競爭，所以能夠按幾何級數(shù)增殖。繼代培養(yǎng)中擴繁的方法包括：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。③使用抗氧化劑 在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。一般來說，處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴重。在褐變過程中，會產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當擴散到培養(yǎng)基后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。許多單子葉植物儲藏器官能強烈地發(fā)生不定芽，用百合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。2) 不定芽的發(fā)育在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過程，形成愈傷組織的細胞。一些木本植物和少數(shù)草本植物也可以通過這種方式來進行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需要通過攪動或振動培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進行培養(yǎng)，其速度一般為50～100r／min，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。放置材料數(shù)量現(xiàn)在傾向少放，通過統(tǒng)計認為：對外植體每次接種以一支試管放一枚組塊為宜，這樣可以節(jié)約培養(yǎng)基和大力，一旦培養(yǎng)物污染可以拋棄。微莖尖要剝成只含1～2片幼葉的莖尖大小等。 (2) 在接種前20rain，打開超凈工作臺的風機以及臺上的紫外燈；(3) 接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實驗服，并換穿托鞋等；(4) 上工作臺后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。最后一步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3～10次左右。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來殺菌的，故滅菌時用廣口瓶加蓋較好；升汞是由重金屬汞離子來達到滅菌的；過氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來殺菌的，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌后用無菌水涮洗3～4次即可；由于用升汞液滅菌的材料，難以對升汞殘毒較難去除，所以應當用無菌水涮洗8～10次，每次不少于3min，以盡量去除殘毒。要在超凈臺或接種箱內(nèi)完成，準備好消毒的燒杯、玻璃棒、70％酒精、消毒液、無菌水、手表等。首先，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當?shù)乃⒆拥人⑾础Ｑ魰r，房間可預先噴濕以加強效果。紫外線的波長為200300nm，其中以260nm．的殺菌能力最強，但是由于紫外線的穿透物質(zhì)的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌；。滅菌時應漸進升溫，達到預定溫度后記錄時間。這樣在實驗中就可以根據(jù)這一規(guī)律加以掌握。培養(yǎng)基中的鐵在高壓滅菌時會催化蔗糖水解，可使15％～25％的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。對于一些布制品，如實驗服、口罩等也可用高壓滅菌。按容器大小不同，保壓時間有所不同見表41。1． 培養(yǎng)基用濕熱滅菌培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。從以上可以看出：在地球表面無菌世界要比有菌世界小得多。初學者首先要清楚有菌和無菌的范疇。打開鍋蓋，加水至水位線。2．培養(yǎng)基的分裝與滅菌培養(yǎng)基合成后要趁熱分裝，100ml的容器約裝入30～40ml培養(yǎng)基，即1L培養(yǎng)基約裝35瓶左右。同時，稱好30g蔗糖，稱瓊脂絲7g(或瓊脂粉)，也傾人小鋁鍋中，邊加熱邊攪拌，防止糊底。再加水定容定濃度。（3）鐵鹽母液 可配成100倍的母液，按表稱取藥品，可加熱溶解，混合后加水定容至1000ml。母液配好后放入冰箱內(nèi)低溫保存，用時再按比例稀釋。一般母液配成比所需濃度高10～100倍。4．B5培養(yǎng)基 是1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設計的。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。培養(yǎng)基的產(chǎn)生最早是Sacks(1680)和Knop(1681)，他們對綠色植物的成分進行了分析研究，根據(jù)植物從土中主要是吸收無機鹽營養(yǎng)，設計出了由無機鹽組成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作為基本的無機鹽培養(yǎng)基得到廣泛應用。此外，％活性炭，還可降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率，對防止產(chǎn)生玻璃苗有良好作用。 抗酚類氧化常用的藥劑有半胱氨酸及Vc，可用50～200mg／L的濃度洗滌剛切割的外植體傷口表面，或過濾滅菌后加入固體培養(yǎng)基的表層?？股馗饔衅湟志V，要加以選擇試用，也可兩種抗生素混用。市售的各種瓊脂幾乎都含有雜質(zhì)，特別是Ca、Mg及其他微量元素。通常所說的煮化培養(yǎng)基，就是使瓊脂溶解于90℃以上的熱水。因此，細胞分裂素多用于誘導不定芽的分化、莖、苗的增殖，而避免在生根培養(yǎng)時使用。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進器官或胚狀體的生長。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細胞分裂素互作促進芽的增殖和生長。在促進生長方面，根對生長素最敏感。添加后可得到健壯的植株。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進作用，但莖尖組織的大小若超過1mm時，椰乳就不發(fā)生作用。如在培養(yǎng)中無特別需要，以不用為宜。通常可由磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化而成，還可進一步生成果膠物質(zhì)，用于構(gòu)建細胞壁。(2) 維生素(vitamin) 這類化合物在植物細胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動，對生長、分化等有很好的促進作用。常加入的有機成分主要有以下幾類：(1) 碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長。7H20和Na2EDTA結(jié)合成螯合物使用。7H20提供。在植物組織培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進對N的吸收，增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。在制備培養(yǎng)基時以N03N和NH4N兩種形式供應。一、培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分主要可以分水、無機鹽、有機物、天然復合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類?？趶接懈鞣N規(guī)格。主要用于切斷莖段、葉片等。包括濾頭，注射器或采用抽濾裝置：真空泵、吸濾瓶、濾氣玻璃管等。2．分注器，小型操作時可采用燒杯直接分裝。一次性塑料容器或帶螺絲帽的玻璃瓶，無須另外配蓋，使用時比較方便。可用于培養(yǎng)較高的試管苗，另外也不易污染。要求由堿性溶解度小的硬質(zhì)玻璃制成，以保證長期貯存藥品及培養(yǎng)的效果；培養(yǎng)用的還要求透光度好，能耐高壓高溫，能方便放人培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的器皿，根據(jù)培養(yǎng)的目的和要求，可以采用不同種類、規(guī)格的玻璃器皿。15．酸度計，組織培養(yǎng)中培養(yǎng)基pH值的準確度是十分重要的，應當使用酸度計，若無酸度計，也可使用pH試紙進行粗測。為進行操作，要有照明裝置。如果是連續(xù)的大規(guī)模生產(chǎn)，應選用大型立式的或臥式的高壓滅菌鍋。2℃，應安置在室內(nèi)較高的位置。超凈臺功率在145～260W左右，它裝有小型鼓風機，使空氣穿過一個前置過濾器，在這里把大部分空氣塵埃先過濾掉，然后再使空氣穿過一個細致的高效過濾器，、細菌和真菌孢子等，最后以較潔凈的氣流吹到工作臺面。短日照植物需要短日照條件，長日照 植物需要長日照條件。高度比培養(yǎng)架略高為宜，周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。 （五)培養(yǎng)室（culturing room）控制無菌室及培養(yǎng)室的配電板等。備有塑料筐，用于運輸培養(yǎng)器皿。植物組織培養(yǎng)是在嚴格無菌的條件下進行的。（3）組織培養(yǎng)具有：培養(yǎng)條件可以人為控制；生長周期短，繁殖率高；管理方便，利于工廠化生產(chǎn)的突出特點，因而發(fā)展迅速。（3）避免外界不利氣候及其他栽培因素的影響，可常年進行保存。2，4D則使培養(yǎng)細胞發(fā)生染色體數(shù)量變化。與自然變異與輻身誘變相比，體細胞無性系變異廣泛而普遍。對于木本植物，莖尖培養(yǎng)得到的植株難以發(fā)根生長，則可采用莖尖微體嫁接的方法來培育無病毒苗。試管快速繁殖應用在下列生產(chǎn)或研究中：(1)繁殖雜交育種中得到的少量雜交種，以及保存自交系、不育系 等。 1960年，Morel提出了一個離體無性繁殖蘭花的方法，其繁殖系數(shù)極高。1971年，Takebe等在煙草上首次由原生質(zhì)體獲得了再生植株，這不僅在理論上證明了無壁的原生質(zhì)體同樣具有全能性，而且在實踐上為外源基因的導入提供了理想的受體材料。即這一比例高時，產(chǎn)生芽；這一比例低時，則形成根；相等則不分化。2．奠基階段 自Haberlandt的實驗之后，直到1934年美國的White由番茄根建立了第一個活躍生長的無性繁殖系，并反復轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，使根的離體培養(yǎng)實驗獲得了真正的成功，并在以后28年間培養(yǎng)了1600代。它與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲害等一系列繁雜勞動，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地。 ③管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制2． 器官培養(yǎng)（organ culture）即離體器官的培養(yǎng)，根據(jù)作物和需要的不同，可以包括分離莖尖、莖段、根尖、葉片、葉原基、子葉、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果實等外植體的培養(yǎng)3．植株培養(yǎng)（plant culture）是對完整植株材料的培