透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝(存儲版)
【正文】 線照 射 ,化 學(xué)誘變 劑 處 理 等。 球 菌的 營養(yǎng) 需求 較高 ,通常 需含 血清 [12,16,24]、 小 牛肉 浸出 液（ vealinfusionbroth） [22]、腦 心浸 出液（ brainheartinfusion） [18]等 培養(yǎng) 基 ，菌體才 能較 好地 生長 ，但這 類營 養(yǎng)物 質(zhì)價 格昂 貴，作為 一般 試驗 研究 可 以 ，大 規(guī)模 生產(chǎn) 中用其作 為培 養(yǎng)基 ，成本 太高 。在 透明 質(zhì)酸 的發(fā) 酵工 藝中 ，大 多 數(shù) 采 用有 氧發(fā) 酵， 也有 的采 用厭 氧發(fā) 酵 [26,27]。 一般 通氣 量為 1~2vvm（ pervolumeofmediumperminute）。 在發(fā) 酵罐 上安 裝一 個在 線的 pH 自 動檢測 控制 裝置 是 很 有 必要 的。 1） 延 長 透 明質(zhì) 酸合 成酶 的生 命期 2） 降 低 生 物量 的合 成， 以減 輕前 提物 資源 的競 爭 3） 增 加 透 明質(zhì) 酸合 成的 前提 物資 源 4） 提 高 細 胞的 能源 效率 （ energyefficiency 研 究 發(fā) 現(xiàn) ,許 多發(fā) 酵參 數(shù)可 顯著 影響 透明 質(zhì)酸的 Ｍ r。首先 要殺 滅和除 去發(fā) 酵液 中的 菌體 ，通常 加 入 殺 菌劑 或 75~80℃ 加熱 進行 滅菌 。 。因此 ，為了 提高透 明質(zhì) 酸的 產(chǎn)率 ，需要對發(fā) 酵 參 數(shù) 條件 和發(fā) 酵液 的配 方進 行優(yōu) 化。根據(jù) 這一 理論 ，菌體 過多 的表 達透 明質(zhì) 酸合 成酶 ，酶分 子之 間會 競爭 同 一 前提 物資源 ，導(dǎo) 致 透 明 質(zhì)酸 Ｍ r 的 降低。發(fā) 酵過 程中，菌體 產(chǎn)生 的醋 酸和 乳酸 等小分子 有 機 酸 的總 量要 大于 透明 質(zhì)酸 ，因 此可 使發(fā) 酵液 的 pH 值以 ~低 ， 需 用 氫氧 化鈉 或碳 酸鈉 溶液 進行 中和 ，以 維持 適當(dāng) 的 pH 值。 Nimrod 等 [29]用 獸 疫鏈球菌 (Streptococcuszooepidemicus)ATCC39920 的 一個 變異 菌株 進行 發(fā)酵 ,在厭 氧條 件下 ,透 明質(zhì) 酸的 產(chǎn)率 為 2g/L。其 他還 有磷 酸鹽、 硫酸 鹽， 鉀、鈉 、鈣、 鎂等 無機 鹽， 鐵、錳 、銅、鋅等 微 量 元 素。由于 透 明 質(zhì) 酸為 動物 體內(nèi) 廣泛 存在 的物 圖 32 鏈球菌及其莢膜光鏡照片 圖 33 透明質(zhì)酸在鏈球菌中的合成路線 ATP：腺苷三磷酸， ADP：腺苷二磷酸， UTP：尿苷三磷酸， UDP：尿苷二磷酸， NAD： 煙 酰胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 ， C oA：輔酶 A， Ac：乙?；?， P：磷酸， PP：焦磷酸 圖 34 透明質(zhì)酸的合成示意圖 16 為合成 HA 的順序 質(zhì) ，無任 何抗 原性 ，以透 明質(zhì) 酸和 水為 主要 成分 組成 的莢 膜 ，覆蓋 在菌 體表 面 ，使 動物機體 的 免 疫 系統(tǒng) 無法 識別 ，免 受攻 擊。因此 ，透明 質(zhì)酸 酶的 產(chǎn)生 對透 明質(zhì) 酸的 發(fā)酵 非常 不利 ，在 菌種 的篩 選時 ，要注意觀 察 判 斷 菌種 是否 同時 產(chǎn)生 透明 質(zhì)酸 酶。 沉淀 用發(fā) 酵體 積的 氯 化 鈉 水 溶液 溶解 ，加 入 %的 活性 炭， 攪拌 吸附 1h。 2）種 子罐 種子 液的 培養(yǎng) 按搖 瓶種 子液 的配 方配 制培 養(yǎng)液 100L，加 入種 子罐 中，通蒸汽加熱， 115℃ 滅菌 30min。 7．沉 淀、干燥 ：將 濾液 倒入 3 倍體積 95%乙 醇中 ，分 出沉 淀 。 三 、 以 動物 眼玻 璃體 為 原料 的制 備工 藝 [3,7,8] （ 一 ） 工 藝路 線 （ 二 ） 工 藝過 程 1．提取 將冷 凍的 牛、豬 或羊 眼球 解凍 ，剝出 玻璃 體，融化 后離 心，分 出上 清，加入 倍 體 積 的 丙酮 沉淀 。取 出沉 淀，重 新溶 解于 的 氯 化 鈉 溶液 中 ,再 次用 3 倍 體積 95%乙 醇沉 淀。用蒸 餾水 反復(fù) 提 取 4 次 ，第一 次加 水量 為脫 水臍帶 10 倍，之 后 三 次 適量 遞減 。透 明質(zhì) 酸與 其它 酸性 粘多 糖聚 陰離 子的 電荷 密度 不同 ，與 CPC 絡(luò)合 生成沉淀 時鹽 濃度 可以 不同 ，絡(luò) 合沉 淀物 解離 所需 的最 低鹽 濃度 也不 同。如細 菌內(nèi) 毒素 是一 種脂 多糖（ lipopoly saccharide），其分子 兼具 脂溶 性和 水溶 性 ，在 進行 氯仿 處理 時，聚集 在氯 仿和 水的 界面 ，利 用這 一性 質(zhì)可除去 細菌 內(nèi)毒 素 。不 同最 終濃 度的 乙醇 沉淀 操作 還可 對不 同 Ｍ r 的 透明 質(zhì)酸 進行 分級 分離 ，在 較低 乙醇 濃度 下 ，低 Ｍ r 的透 明質(zhì) 酸不 易被 沉淀 出來 ， Ｍ r 越 高 ，越 容易 被沉 淀。后 者的 提取 效率 高，幾乎 達到 完全 提取 ，但 提取液中 的雜 質(zhì) 含 量也 較高 。 6．絡(luò) 合沉 淀酶 解結(jié) 束后 ，向 酶解 液中 加入 同體 積的 1%氯 化十 六烷 基吡 啶（ CPC）溶液 ，靜 置 ， 收 集 HACPC 絡(luò)合 沉淀 。細菌 發(fā)酵 法與 動物 組織 提法 相比，具有 生產(chǎn)規(guī)模 不受 動物 原料 限制 ，發(fā)酵 液中 透明 質(zhì)酸 以游 離狀 態(tài)存 在 ,易于 分離 純化 ，成本 低，易于形成 規(guī)模 化工 業(yè)生 產(chǎn) ，無 動物 來源 的致 病病 毒污 染的 危險 等優(yōu)點 。 細菌 發(fā)酵 法是 利用 某些 種屬 的鏈 球菌 ，在 生長 繁殖 過程中 ，向 胞外 分泌 以透 明質(zhì) 酸為 主要 成分 的莢 膜。 5． 酶 解 將 水相 用稀 氫氧 化鈉 溶液 調(diào) ,加入 適量 鏈霉 蛋白 酶 ,37℃ 酶解 24h。磨 成糊 狀后 ，可 先用 水提 取， 過濾 除去 雞冠 殘渣 得提 取液 ，然 后進 行酶 解除 蛋白質(zhì) ；也 可將 水提 取和 蛋白 酶水 解同 時進 行 。 4．醇 沉淀 是分 離提
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