【正文】 優(yōu)點是時刻變化的OD值是與反應產(chǎn)物的數(shù)量成正比的，也就是吸光度變化曲線與凝膠產(chǎn)物的產(chǎn)生關系為線性，我們也采用與國際上其他儀器相同的取值，該點在反應曲線上的位置為濁度開始快速變化的時期，該取值能夠快速、穩(wěn)定的獲得反應時間。檢測樣品反應時間通過標準曲線反算濃度度lgTlgClgClgTTxCx系列稀釋標準品與反應時間回歸標準曲線歸標準曲線圖14反應時間法定量測定原理反應速率法標準曲線的測定未知內毒素原理大量試驗表明，內毒素濃度越高成膠時間就越快，即反應速度快，將動力學反應曲線變換成微分曲線，即反應速率曲線，OD/min時間Vm3Vm2Vm1OD時間其反應速率最大的點即是反應曲線的拐點，該點的時間作為反應時間就是反應時間法中的T50法，最大的反應速率也與內毒素含量相關，經(jīng)實驗證明，最大反應速率Vmax與內毒素濃度的對數(shù)成正比，內毒素濃度越大最大反應速率越大，其經(jīng)驗公式如下： Vmax = a0+ b0LgC通過對標準品進行實驗，可得CVmax關系曲線，對該曲線采用最小二乘法擬合，可以求解出a0、b0的值。（常用）方法2：用三效熱原滅活劑配制的溶液放在超聲波洗滌機里對玻璃用具進行開機清洗10分鐘，然后先用清水清洗數(shù)遍，再用蒸餾水沖洗數(shù)遍，最后放入烤箱，在250℃的溫度下烘烤2小時。h)放射性藥品注射劑K＝(kg MVD=LC/λ1 D=LC/λm式中 L為供試品的細菌內毒素限值。標準曲線的構造在進行標準系列的制備時，2至10倍的稀釋方法都可以使用，不過，其中對倍稀釋和10倍稀釋較為方便也比較常用。 陰性對照中的內毒素含量必須明顯低于最低檢測限值，否則試驗無效。3．調整PH值有些樣品PH值偏高或偏低，且鱟試劑中PH緩沖劑不能將反應液調整至正常范圍。沖洗液按常規(guī)法測定。當回收率在50－200％之間時，則表示該供試品在此濃度下對鱟試劑反應不干擾，可進行內毒素檢測，否則就需進行更大倍數(shù)的稀釋或采用其它的方法來排除干擾。 制備回收試驗管的方法一般為，混勻即可。2．(13)βDglucan的檢測它可以與鱟試劑中G因子系反應，同內毒素與鱟試劑中C因子系反應一樣，其中被激活的凝固酶切斷凝固蛋白原中特定位置的精氨肽鏈，形成凝固蛋白產(chǎn)生凝膠的濁度變化，造成假陽性結果。 ?！　：為確保樣品溶液與LAL（TAL）試劑反應無干擾因素的影響，添加內毒素樣品溶液樣品陽性對照管測得的回收率必須在50~200%以內。標準曲線的稀釋操作時間也不要過長，控制在半小時以內為好。3． 細菌內毒素檢測用水為了避免實驗受到污染，可能造成不好結果，要特別注意下列檢測用水，建議：溶解內毒素標準品的水不可再用；溶解鱟試劑的水要重新開啟；做陰性對照的水要重新開啟。儀器適用范圍216。 反應時間分析法216。 檢測波長： [660nm] 檢測時間：2000秒~25000秒自由選擇216。216。添加新檢驗員姓名被貯存，再次登陸時可在用戶登錄框中找到。1．1 檢品管理中心它的作用與Windows的資源管理器目錄欄相仿，所有實驗數(shù)據(jù)都以文件夾的形式存在其中，目錄按檢測藥品分類，可自行定制目錄名。2．2 參數(shù)設定1． 光源的切換打開儀器電源，進入軟件，點擊右上角圖標，進入儀器設置。2．3 數(shù)據(jù)合并其功能可對任意多個實驗數(shù)據(jù)進行合并，處理數(shù)據(jù)。我們將非常感謝您的參與。填好鱟試劑批號，內毒素批號，檢查用水批號；“初始濃度”為標準曲線的最高濃度點；“稀釋梯度”為各標準點之間的稀釋倍數(shù)，可選也可輸入，小數(shù)也可；“濃度點數(shù)”為所做標準曲線點的個數(shù)；“平行管數(shù)”為各點重復的管數(shù)。1． 如果只做一個倍數(shù)下的回收率試驗，在“樣品稀釋組數(shù)”中填入“1”即可；2． 如果做多倍數(shù)回收率試驗，則需要填好“樣品稀釋組數(shù)”和“樣品稀釋梯度”，那么，單擊“自動設置樣品”，該界面表格以所填好的“稀釋倍數(shù)”為起始點開始顯示每一稀釋倍數(shù)下的回收率及樣品管設置。單擊“建立新建檢品文件夾”即可在樣品名稱選項中及“檢品管理中心”找到該文件名。實驗時反應管要與所選孔位一一對應，避免所填表格與實際插入不同，造成檢測失敗，孔位選好后，單擊“開始檢測”鍵，軟件返回主界面，新建的子界面內出現(xiàn)我們剛設計好的表格，這時可以對照表格所示插入反應管進行檢測。實驗進行中的子界面：在實驗向導中設置實驗完成后，點擊“開始檢測”，子界面顯示如下：子界面由“實驗數(shù)據(jù)記錄”，“反應曲線”，“結果打印預覽”三部分組成，單擊子界面上方的這三個選項可以進行切換顯示（終止實驗前“結果打印預覽”為空白）。也可在實驗進行中點擊該方框重新輸入反應時間（以秒為單位）?！盎厥章省睓? 實驗進行時此欄為空白“實測內毒素”欄 實驗進行時此欄為空白觀察反應曲線在實驗進行當中，點擊此選項進入反應曲線界面?！皹藴是€”欄內全部是與當前窗體實驗同一批號鱟試劑所做的標準曲線?！巴饧觾榷舅亍睓? 做干擾實驗時，參與回收率的計算。實驗分析方法：“分析方法”框中有三種方法，分別為反應時間法、反應速率法、歸一化法。該界面提供同坐標查看各反應管的反應曲線、速率曲線及最大速率曲線，并可根據(jù)需要打印曲線，它為分析各樣品的反應特征提供了有力的幫助?！邦A設OD值”選項可設置反應曲線到達預定OD值時，儀器將記錄反應的時間作為反應完成的時間，該值的改變將影響反應時間取值的變化，建議非特殊情況不改變其值。圖中是內毒素標準品的速率曲線，可以看到有一個明顯的波峰。進入臨床報告單后，下半部為要打印的內容。如何進行溫度設定與校準　打開儀器電源，重新啟動軟件，連接后鼠標點擊右上角溫度方框，進入儀器設定界面。如果插入試管后儀器沒有反應，因為儀器根據(jù)光路變化智能自動識別所插試管，如果試管插入前后試管孔內光路變化甚微，則無法識別；解決方法稍微轉動一下試管即可，如還沒反應可拔出重插。第五章 實驗操作指南實驗設置向導　　 如果你對軟件實驗向導的表格設置還不能靈活應用，可先參考下列示范：1． 標準曲線，然后在“陰性陽性對照設置”中選擇陰性對照管數(shù)，最后在“試管位置選擇”中選擇反應管位置后單擊檢測即可。在“陰性陽性對照設置”中選中“陰性設置”，選好“管數(shù)”，然后在“試管位置選擇”中選擇反應管位置后單擊檢測，然后在生成的表格中重新填寫即可。點擊[生成標準曲線]鍵，則自動對數(shù)據(jù)進行計算。 值：（2000年藥典規(guī)定）EU/ml 四個濃度樣品稀釋管，每點2個平行管，共8管； 靜置23分鐘，加到26個專用試管。結果分析：|r|= ，符合要求；——供試品稀釋：供試品作為原液 1ml 1ml 1ml 1ml——加樣檢測：：注意加樣前應混旋內毒素溶液30秒，且每個濃度點應更換加樣頭，每加完2平行管后封口，可在混合器上一起震蕩1秒，然后插入反應器（儀器已提前加熱，軟件已啟動檢測），注意各反應孔與軟件界面所添表格的對應；重新開啟一支內毒素檢查用水，做2管陰性對照。樣品稀釋400倍時所測內毒素值最接近真實值?！c試劑溶解：標準曲線四個點，每點2個平行管，2管陰性對照，共10管；四個濃度干擾試驗，每點2個平行管，共8管；四個濃度樣品稀釋管，每點2個平行管，共8管；共計26管。加入已知的內毒素為標準曲線中間濃度。 2. 各稀釋倍數(shù)下樣品：同上。注意每個濃度點加樣頭的更換 。 取樣前震蕩30秒，取樣時要在溶液中反復沖洗加樣頭幾次?！┰嚻废♂專?溶解后的供試品作為原液每個濃度點在加完樣后應立即用封口膜封口，放入反應器中，開始檢測。點擊“自動設置”，在“陰性陽性對照設置”中根據(jù)需要選擇陰性對照，陽性對照，最后在“試管位置選擇”中選擇反應管位置后單擊檢測即可。表格填寫如有錯誤可更改后再分析，但不可保存。如何識別試管插入后檢測與否新實驗開始（即實驗向導設置完畢），當試管插入儀器后，怎樣證明儀器開始檢測呢？BET32B型儀器：每插入一試管，儀器蜂鳴器便叫一聲，10秒以內軟件對應表格中的反應時間欄開始記時，每插一管單獨記時。如何進行實驗數(shù)據(jù)的添加與刪除在“資源管理器”中找到軟件路徑（默認路徑為C:﹨Program files﹨EasyBET），實驗數(shù)據(jù)存在該路徑下的文件夾中，在文件夾中可以進行實驗數(shù)據(jù)的添加與刪除。點擊該鍵進入該界面，如果退出該界面后再點擊該鍵，則出現(xiàn)一個提示框“你已經(jīng)輸出一個報告，是否用新值覆蓋原報告”。112為含有葡聚糖樣品的曲線，它的走向是從一開始就平緩抬升。零化期時間設定的意義是由于某些鱟試劑在反應初期有特異性，比如反應曲線向上走，過零化期的處理，反應曲線就回趨于正常，這樣能有效排除干擾。從實驗數(shù)據(jù)中我們可以看到。再單擊該試管號，紅色消失，使其復原。每按一次“page up”或“page down”所點擊的該樣品名稱欄中會依次出現(xiàn)“內毒素標準”“陰性對照”“陽性對照”字樣和空白格。點擊后出現(xiàn)提示框“是否將標準曲線平行管取平均”，選擇回答后，提示“要將該直線存儲為標準曲線嗎”，如果保存則以該實驗所用“鱟試劑批號+內毒素批號+日期+時間”作為文件名，生成的標準曲線方程及相關系數(shù)r值顯示在坐標下方。其它項目名稱含義：“反應時間”欄 記錄各試管插入儀器后的反應時間?！笆Ｓ鄷r間”框顯示反應距定時時間的剩余時間。而且每個窗口也可做不同樣品檢測，檢測管數(shù)也不受限制，用戶可根據(jù)實際情況靈活設計表格?？孜粩?shù)量不夠不能檢測，孔數(shù)超過軟件會出現(xiàn)提示?！靶陆z品文件夾”：它的作用可在檢品管理中心新建文件名。 “添加內毒素濃度”：內毒素添加值根據(jù)所做標準曲線填入（見附錄1藥典規(guī)定）；“樣品稀釋組數(shù)”：如果對樣品進行不同倍數(shù)稀釋，表示需要幾個梯度；“樣品稀釋梯度”：表示樣品不同倍數(shù)稀釋間的倍數(shù)；以上三項根據(jù)需要填入。下面對其各欄進行說明：2．5．1 標準曲線設置該向導為標準曲線自動填好實驗表格，也可調用以前所存標準曲線。同理打開要拆分的數(shù)據(jù)，把選中所需項上傳到“選中的數(shù)據(jù)”框中，以其它名稱保存即可。4． [默認預設OD限值]選項表示OD值達到此值時的反應時間參與標準方程的計算。2． 菜單欄該菜單欄包括：“退出”、“數(shù)據(jù)合并”、“新實驗”及“網(wǎng)站鏈接”。四．軟件使用詳述（一）主界面在軟件運行以后進入主界面，主界面由菜單欄，左文件管理欄和子窗體（即窗體空白部分也就是實驗數(shù)據(jù)處理界面）組成。三．軟件與儀器通訊首先，把儀器與電腦主機用隨機配置的串口電纜連接起來，電腦主機一般有兩個串口，接入任一個都可以，然后由軟件切換串口進行連機。216。216。 檢測波長： [450nm]藍光 ， [660nm]紅光雙波長可調檢測孔數(shù)：72個，612方形排列 檢測間隔：10秒 操作方式：電腦連機操作 檢測孔數(shù)：48個，412排列或 濁度試劑（廈門、海洋、安度斯、新北等4家鱟試劑廠） 216。 2001年，為了適應臨床，藥廠多檢品，多任務的需求，我們開發(fā)出具有72個反應孔的雙波長BET72型。當室溫過高時應使用冰浴槽，將溶解的鱟試劑降溫。 鱟試驗過程中注意事項： 1． 內毒素工作品 細菌內毒素是一種脂多糖大分子，很容易吸附到實驗器具壁上，其水溶液放置一端時間后其活性就會降低，在旋渦混合器上充分震蕩，其活性就會恢復。在標準曲線以外的數(shù)值根據(jù)情況一般不參與計算。 ，平行管的變異系數(shù)不應大于10%。分子結構具用多樣性。而對于由4,5或6個點組成的兩倍稀釋有標準曲線來說，選用4λ1的標準濃度也是比較常用的一種方法。（2）干擾實驗即為回收實驗，供試品回收試驗是在供試品或供試品的稀釋液中加入某一已知濃度標準內毒素，再與鱟試劑進行反應，然后用此溶液的內毒素檢測值減去供試品或其稀釋液本身的內毒素檢測值，即得到內毒素回收值。卸開濾器，將濾膜反向放置濾器上，嚴密固定。2．加熱法有些干擾因子為不耐熱的物質，將樣品在適當溫度下保持一端時間，即可按常規(guī)方法測定。例如10，1，＂λ＂。 如果樣品所測內毒素值較低，調整后的最低標準濃度點過低，影響到標準曲線的檢測，則不需調整。 按人用計量計算L值時，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實際作必要調整。 K為按規(guī)定的給藥途徑，臨床無任何不良反應的內毒素閾劑量，以EU/kg 試驗用具的處理：實驗中用到的試管，加樣頭等玻璃用具要提前進行除熱原處理，除熱原的處理方法有多種，最常用的方法為烘烤。實驗證實，臨界時間與內毒素濃度C之間也是負相關，其經(jīng)驗公式如下【11】： ()對上式兩邊取對數(shù)可得： ()通過對標準品進行實驗，可得C關系曲線，對該曲線采用最小二乘法擬合，可以求解出a0、b0的值。二、終點分析方法終點濁度法：利用當反應曲線達到設定時間時的吸光度值與內毒素含量的對數(shù)擬合標準曲線，由于凝膠以后濁度不再上升，所以所有參加計算的點必須在產(chǎn)生凝膠以前，否則將產(chǎn)生很大誤差?！笔俏覀円滋嶒炇业淖谥?；“Always try it for best”是我們的信念, 希望我們的工作給您予幫助。自從美國藥典20版(1980年)收載了“細菌內毒素檢查法”以來，美國藥典收載的藥品中，原規(guī)定的熱原檢查項逐漸被細菌內毒素檢查項所取代，一些