實(shí)驗(yàn)三血清γ-球蛋白的分離、純化及鑒定七年制(存儲(chǔ)版)
【正文】 ： 加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素并使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象 。 Vi， 0Kd1 （ 3）完全滲透的小分子， Ve=Vo+Vi， Kd=1 ▲ Sephadex G25的準(zhǔn)備 ▲ 裝柱（ 15~20cm） 操作步驟： 層析柱保持垂直。用 奈氏試劑 檢測NH4+。如果其帶負(fù)電，則能結(jié)合陽離子，成為 陽離子交換劑 ；如果其帶正電，則能結(jié)合陰離子，稱為 陰離子交換劑 。 ２ .裝柱時(shí)檢查是否漏水。 蛋白質(zhì)的電離示意圖 基本原理 以醋酸纖維薄膜作為支持體的一種電泳方法。 點(diǎn)樣：浸于巴比妥溶液中的薄膜，濾紙輕輕吸 干 — 半干燥態(tài)。 注意事項(xiàng)： 區(qū)分電泳槽正負(fù)極。 漂洗：漂洗液浸洗 3次，每次 510min。以血清蛋白圖譜為對(duì)照，觀察提純物屬哪種蛋白，其純度如何？ 操作步驟： 裝置電泳箱。 每 ml純化 γ －球蛋白溶液加 Sephadex G25 g，搖動(dòng) 2～ 3分鐘，離心 3000r/min， 5分鐘，上清即為濃縮γ 球蛋白（或用冷凍干燥儀使其濃縮）。用該緩沖液洗脫下來的是γ－球蛋白。 三、 DEAE－纖維素離子交換層析 【 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?】 1. 通過使用 DEAE－纖維素離子交換層析法 ， 進(jìn)一步 純化 γ 球蛋白脫鹽液 ， 得到較純的 γ 球蛋白溶液 2. 學(xué)習(xí)了解離子交換層析方法的基本原理和應(yīng)用 離子交換層析的基本原理 離子交換層析是一種常用的、通過使用各種類型的離子交換劑達(dá)到分離純化目的的層析方法。 ▲ 加樣與洗脫 ▲ 凝膠的再生 加樣： 用滴管將鹽析后樣品加入柱床面，打開出口使樣品 溶液滲入凝膠。層析時(shí)，直徑大于凝膠網(wǎng)孔的 大分子物質(zhì) 不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，只能沿著凝膠顆粒間的間隙隨流動(dòng)相向下移動(dòng)，所以流程短、流速快，首先流出層析柱；而 小分子物質(zhì) 直徑小于凝膠網(wǎng)孔能自由出入，洗脫時(shí)間長，后流出層析柱，經(jīng)過一定時(shí)間 層析，分子大小不同的物質(zhì)彼此分開，達(dá)到分離的目的 。 實(shí)驗(yàn)思路 分段鹽析去除雜蛋白 凝膠層析脫鹽 交聯(lián)葡聚糖吸水濃縮 醋酸纖維素薄膜電泳鑒定 先粗后細(xì) 離子交換層析純化 一、鹽析法
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