【正文】 b）移去皿蓋將未洗過的手指在瓊脂平板的表面，輕輕地來回劃線，蓋上皿蓋。不是劃線的平板，也一分為四，數(shù)1/4面積的菌落數(shù)。(e)高度 扁平、隆起、凹下。菌落特征的觀察也是檢查菌種純度，辨認(rèn)和鑒定菌種的重要依據(jù)。通過培養(yǎng)基平板檢查空氣環(huán)境中微生物數(shù)量和類型，可用于測(cè)定空氣質(zhì)量和污染指數(shù)的評(píng)定。N100100πｒ2X=X：每m3空氣中的細(xì)菌數(shù)N：平板暴露5分鐘，置37℃培養(yǎng)24小時(shí)后生長的菌落數(shù)r：平皿底半徑（㎝）五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 菌落平均數(shù)環(huán)境細(xì)菌霉菌放線菌室外5min10min室內(nèi)5min10min2．用沉降法計(jì)算1m3空氣環(huán)境中所含菌數(shù)。最好是將平板放室溫2—3天，或37℃培養(yǎng)24小時(shí)，檢查無菌落及皿蓋無冷凝水后再使用。3．平板劃線分離法（1）按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號(hào)筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱。（3）挑菌 同稀釋涂布平板法，直到獲得純培養(yǎng)。三、器材肉膏蛋白胨脂培養(yǎng)基，滅菌水，冰箱，滅菌三角燒瓶，滅菌的帶玻璃塞瓶，滅菌培養(yǎng)皿，滅菌吸管，滅菌試管等。(b)分別傾注約15ml已溶化并冷卻到45℃左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，并立 即在桌上作平面旋搖，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。(b)自最后三個(gè)稀釋度的試管中各取1ml稀釋水加入空的滅菌培養(yǎng)皿中，每一稀釋度做三個(gè)培養(yǎng)皿。若其比值小于2，應(yīng)采取兩者的平均數(shù)。大腸菌群是一群以大腸埃希氏菌（Escherichia　coli）為主的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在37℃生長時(shí)，能在48小時(shí)內(nèi)發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣。3．復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)以上大腸菌群陽性菌落，經(jīng)涂片染色為革蘭氏陰性無芽孢桿菌者，通過此試驗(yàn)再進(jìn)一步證實(shí)。（2。48小時(shí)后仍不產(chǎn)氣的為陰性結(jié)果。2．了解大腸菌群的數(shù)量在飲水中的重要性。（2）首先選擇平均菌落數(shù)在30—300之間的，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該水樣的細(xì)菌總數(shù)。稀釋倍數(shù)看水樣污濁程度而定，以培養(yǎng)后平板的菌落數(shù)在30—300個(gè)之間的稀釋度最為合適，若三個(gè)稀釋度的菌數(shù)均多到無法計(jì)數(shù)或少到無法計(jì)數(shù)，則需繼續(xù)稀釋或減小稀釋倍數(shù)。2．細(xì)菌總數(shù)測(cè)定（1）自來水(a)用滅菌吸管吸取1ml水樣，注入滅菌培養(yǎng)皿中。在水質(zhì)衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)中，細(xì)菌總數(shù)是指1ml水樣在肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，置37℃經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后，所生長的細(xì)菌菌落的總數(shù)。(b)將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。（5）挑菌 將培養(yǎng)后長出的單個(gè)菌落分別挑取接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置28℃和37℃溫室中培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其他雜菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。四、操作步驟1．稀釋涂布平板法（1）倒平板 將肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基溶化，待冷至55—60℃時(shí)，然后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿，其方法是右手持盛培養(yǎng)基的三角燒瓶，置火焰旁邊，左手拿平皿并松動(dòng)瓶塞，用手掌邊緣和小指、無名指夾住拔出，如果三角燒瓶內(nèi)的培養(yǎng)基一次可用完，則瓶塞不必夾在手指中。（4）蓋上皿蓋，將平板倒置，置于28℃溫箱中，細(xì)菌培養(yǎng)48小時(shí)，霉菌與放線菌培養(yǎng)時(shí)間分別為4—6天，計(jì)算其菌落數(shù)，觀察菌落形態(tài)、顏色等?？諝庵械奈⑸镒匀怀两涤谂囵B(yǎng)基的表面，經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)其上生長的菌落數(shù)，按公式計(jì)算1m3空氣中的微生物總數(shù)。2．通過觀察和比較各類微生物的菌落特征，達(dá)到初步鑒別微生物類群的能力。(c)干濕情況 干燥、濕潤、粘稠。4．將所有的瓊脂平板翻轉(zhuǎn)，使皿底在上，放37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1—2天。整個(gè)劃線操作均要求無菌操作，即靠近火焰，而且動(dòng)作要快。再將棉簽伸入，在瓊脂表面頂端接種（滾動(dòng)一下），立即閉合皿蓋。用記號(hào)筆寫上班級(jí)、姓名、日期，本次實(shí)驗(yàn)還要寫上樣品來源，字盡量小些，寫在皿底的一邊，不要寫在當(dāng)中，以免影響觀察結(jié)果。2．比較來自不同場(chǎng)所與不同環(huán)境條件下微生物的數(shù)量和類型。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，使鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。三、器材微生物培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿（12套一包），手提式高壓蒸汽菌鍋，實(shí)驗(yàn)材料等。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低；二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100℃時(shí)，（千焦）的熱量。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。如果配制固體培養(yǎng)基，將稱好的瓊脂放入已溶化的藥品中，再加熱溶化，在瓊脂溶化的過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。7H2O，KH2PO4，麥芽糖，乳糖，溴甲酚紫，乙醇；1mol/L NaOH，1mol/L HCL；試管，中套管，小倒管，三角燒瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙，高壓蒸氣滅菌鍋，pH試紙（—）棉花，牛皮紙，記號(hào)筆，麻繩，紗布，蒸餾水等。接物鏡接物鏡倍數(shù)目鏡測(cè)微尺格數(shù)鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)目鏡測(cè)微尺每格代表的長度（μm）低倍鏡高倍鏡油 鏡接目鏡倍數(shù)_______________________2．在高倍鏡和油鏡下測(cè)量枯草芽孢桿菌大小，將結(jié)果填入下表。圖4 目測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺①目鏡測(cè)微尺②鏡臺(tái)測(cè)微尺③鏡臺(tái)測(cè)微尺的中心部放大④鏡臺(tái)測(cè)微尺標(biāo)實(shí)目鏡測(cè)微尺時(shí)兩者重疊 （2）放置鏡臺(tái)測(cè)微尺 將鏡臺(tái)測(cè)微尺置于顯微鏡的載物臺(tái)上，使刻度面朝上。用來測(cè)量微生物細(xì)胞大小的工具有目鏡測(cè)微尺（圖3）和鏡臺(tái)測(cè)微尺（圖4）。5．清洗血球計(jì)數(shù)板使用完畢后，將血球計(jì)數(shù)板在水籠頭上用水柱沖洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。靜置5—10分鐘即可計(jì)數(shù)。所以無論是哪種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格數(shù)都是相同的。二、基本原理利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。（5）鏡檢 干燥后，置油鏡觀察。2．涂片　本實(shí)驗(yàn)采用“三區(qū)”涂片法。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當(dāng)用乙醇處理時(shí)由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞內(nèi)而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍(lán)紫色；革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復(fù)染液（番紅）的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．繪出你所觀察到的經(jīng)單染色的兩種細(xì)菌形態(tài)圖。3．固定 涂片面向上，于火焰上通過2—3次，使細(xì)胞質(zhì)凝固，以固定細(xì)菌的形態(tài)，并使其不易脫落。堿性染料并不是堿，和其他染料一樣是一種鹽，電離時(shí)染料離子帶正電，易與帶負(fù)電荷的細(xì)菌結(jié)合而使細(xì)菌著色。常見種類有肋楯纖蟲（Aspidisca costata）、尖毛蟲（Oxytricha）、棘尾蟲（Stylonychia）、瘦尾蟲（Uroleptus）等。（3）纖毛蟲（Ciliata）：纖毛蟲是原生動(dòng)物中進(jìn)化到高一級(jí)的類群，在結(jié)構(gòu)上比較復(fù)雜。通常有卵圓形、橢圓形、杯形、雙錐形及多角形等等。2．借助顯微鏡觀察藻類個(gè)體形態(tài)，通過實(shí)驗(yàn)了解藻類的特征，細(xì)胞等的構(gòu)成，是藻類分類的重要依據(jù)。2．用鑷子夾蓋玻片一塊，小心地蓋在液滴上。繁殖方式也較復(fù)雜，無性繁殖主要是出芽生殖，僅裂殖酵母屬是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通過接合產(chǎn)生子囊孢子。（1）向霉菌斜面試管中加入5ml無菌水，洗下孢子，制成孢子懸液。三、器材曲霉（Aspergillus sp.），青霉 (Penicillium sp.)，根霉(Rhizopus sp.)，毛霉(Mucor sp.)；乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液，20%甘油，馬丁氏（Martin）培養(yǎng)基平板或查氏培養(yǎng)基平板，無菌吸管，載玻片，蓋玻片，U形棒，解剖刀，玻璃紙，濾紙等。將培養(yǎng)體表面貼在涂有樹膠的玻片上，用另一玻片輕輕按壓（不要壓碎），然后將放線菌培養(yǎng)體小心棄去，注意不要使培養(yǎng)體在玻片上滑動(dòng)，否則印痕模糊不清。（2）用火焰滅菌的鑷子將無菌蓋玻片以45度傾斜角插入平皿培養(yǎng)基瓊脂內(nèi)，然后將孢子懸液（濃度以稀釋102—103為好），接種在蓋玻片與平皿培養(yǎng)基的界面上。附：玻璃紙滅菌方法：在玻璃紙滅菌時(shí)，若直接將干燥的玻璃紙滅菌，它就會(huì)縮小，不便使用。三、器材顯微鏡，載玻片，蓋玻片，玻璃棒，接種鏟，小刀，鑷子，土樣，石炭酸復(fù)紅染液，呂氏堿性美藍(lán)染液，加拿大樹膠，玻璃紙，高氏1號(hào)培養(yǎng)基；培養(yǎng)皿等。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告？分別是？、高倍鏡和油鏡下觀察到的細(xì)菌形態(tài)圖。如油鏡已離開油面而仍未見物像，必須再從側(cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作至物像看清為止。將三型涂片玻片標(biāo)本置鏡臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推動(dòng)器，使觀察對(duì)象處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器，㎝處，由目鏡觀察，此時(shí)可適當(dāng)?shù)乜s小光圈，否則視野中只見光亮一片，難見到目的物，同時(shí)用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒，直至物像出現(xiàn)后再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚時(shí)為止，然后移動(dòng)標(biāo)本，認(rèn)真觀察標(biāo)本各部位，找到合適的目的物，并將其移至視野中心，準(zhǔn)備用高倍鏡觀察。熒光顯微鏡主要用于觀察材料中熒光染料著色的色素顆粒等特殊成分?！L之間。這2組光線分別從相板上的環(huán)區(qū)和環(huán)外區(qū)通過，導(dǎo)致它們之間微弱的相位差人為地?cái)U(kuò)大增強(qiáng)，進(jìn)而在上面透鏡的收斂作用下，這2組光線復(fù)在一條光路上發(fā)生干涉效應(yīng)，使得相位差轉(zhuǎn)變成振幅差（即明暗差），反差增強(qiáng)。4．不能隨意拆卸顯微鏡，尤其是物鏡、目鏡、鏡筒不能隨意拆卸，因拆卸后空氣中的灰塵落入里面引起生霉。擦凈載物臺(tái)和物鏡，將各部分還原，注意物鏡頭不可正對(duì)鏡臺(tái)孔，裝鏡入箱。滴1滴香柏油于玻片標(biāo)本待觀察的區(qū)域上，將油鏡頭轉(zhuǎn)至工作位置，眼睛從側(cè)面注視，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦螺旋，直至油鏡頭浸沒于香柏油內(nèi)，幾乎與載玻片相接觸，但不能相碰。如果觀察的目標(biāo)不在視野中央，可調(diào)節(jié)標(biāo)本移動(dòng)器，使之恰好位于視野中央。（3）對(duì)光　配置內(nèi)置式電光源的顯微鏡可直接打開電源開關(guān)，并調(diào)節(jié)光量，使視野內(nèi)的亮度達(dá)到明暗適宜，同時(shí)打開光圈。光源（light source）較新式的顯微鏡其光源通常是安裝在顯微鏡的鏡座內(nèi)，通過按扭開關(guān)來控制；老式的顯微鏡大多是采用附著在鏡臂上的反光鏡，反光鏡是一個(gè)兩面鏡子，一面是平面，另一面是凹面。目鏡（coular lens）裝于鏡筒上端，由兩塊透鏡組成。在載物臺(tái)上有的裝有兩個(gè)金屬壓夾稱標(biāo)本夾，用以固定標(biāo)本；有的裝有標(biāo)本推動(dòng)器，將標(biāo)本固定后，能向前后左右推動(dòng)。鏡臂有固定式和活動(dòng)式兩種，活動(dòng)式的鏡臂可改變角度。1．機(jī)械裝置鏡座(base)和鏡臂(arm)鏡座位于顯微鏡底部,呈馬蹄形，它支持全鏡。載物臺(tái)(stage)又稱鏡臺(tái)，為方形或圓形的盤，用以載放被檢物體，中心有一個(gè)通光孔。其中“NA ”表示數(shù)值孔徑（numerical　aperture,簡寫為NA），“10”表示放大倍數(shù)，“160/”分別表示鏡筒長度和所需蓋玻片厚度（㎜），“16㎜”表示焦距。調(diào)節(jié)聚光鏡的高度和虹彩光圈的大小，可得到適當(dāng)?shù)墓庹蘸颓逦膱D像。（2）檢查　檢查各部件是否完好，鏡身、鏡頭必須清潔。（5）低倍鏡觀察　用粗調(diào)焦螺旋調(diào)焦后，再輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)焦螺旋，以便得到清晰的物像。（7）油鏡觀察　轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦螺旋，使物鏡與鏡臺(tái)保持一定距離。（8）復(fù)原　顯微鏡使用完畢，關(guān)閉電源，將物鏡鏡頭轉(zhuǎn)開，取下玻片。3．透鏡要用擦鏡紙擦拭，若僅用擦鏡紙擦不凈，可用擦鏡紙蘸二甲苯拭擦，但用量不宜過多，拭擦?xí)r間也不宜過長，以免粘合透鏡的樹脂被溶化，而使透鏡膠落。環(huán)狀光闌的作用是形成一個(gè)空心的光線錐，造成透過標(biāo)本的光線分離成直射光和衍射光2組光線。它的成像特點(diǎn)是：黑暗的視野中可見明亮的被檢物體的明細(xì)外貌及其運(yùn)動(dòng)，但是看不見被檢物體內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)。也可以用顯微鏡外加輕便熒光光源代替熒光顯微鏡，其觀察原理相同，只是觀察效果略差。2．低倍鏡觀察檢查的標(biāo)本需先用低倍鏡觀察，因?yàn)榈捅剁R視野較大，易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定檢查的位置。 ?。?）從接目鏡內(nèi)觀察，進(jìn)一步調(diào)節(jié)光線，使光線明亮，再用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野出現(xiàn)物像為止，然后用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。同時(shí)把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞，反光鏡垂直于鏡座。氣生菌絲及孢子的形狀和顏色常作為分類的重要依據(jù)。（6）將載玻片置顯微鏡下觀察。（1）將高氏1號(hào)培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿，制成4㎜左右的培養(yǎng)基平板，經(jīng)培養(yǎng)檢驗(yàn)后無菌，備用。然后用小刀切取放線菌培養(yǎng)體一塊（帶培養(yǎng)基切下）。霉菌的菌絲、分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)常作為分類的重要依據(jù)。（4）在培養(yǎng)皿的濾紙上，加無菌的20%甘油數(shù)毫升，至濾紙濕潤即可停加，將培養(yǎng)皿置28℃培養(yǎng)一定時(shí)間后，取出載玻片置顯微鏡下觀察。二、基本原理酵母菌是多形的、不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞微生物，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)已有明顯的分化，菌體比細(xì)菌大。然后按無菌操作法取在瓊脂斜面上培養(yǎng)48小時(shí)的酵母菌少許，放在呂氏堿性美藍(lán)染液中，使菌體與染液均勻混合。？ 實(shí)驗(yàn)六 原生動(dòng)物和藻類個(gè)體形態(tài)的觀察一、目的要求1．進(jìn)一步熟悉和掌握顯微鏡的操作方法2．觀察原生動(dòng)物和藻類個(gè)體形態(tài)，掌握生物圖的繪制方法二、基本原理1．原生動(dòng)物以細(xì)菌和顆粒狀有機(jī)物或溶解性有機(jī)物為食，它對(duì)廢水的凈化起重要作用，原生動(dòng)物易于通過顯微鏡觀察和分辨，因而可作為指示生物，通過觀察原生動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)來評(píng)價(jià)水質(zhì)污染程度。1．細(xì)胞具色素體；貯藏物質(zhì)為淀粉或脂肪…………………………………………21．細(xì)胞無色素體，色素分散在原生質(zhì)中；貯藏物質(zhì)以藍(lán)藻淀粉為主………………………………………………………………藍(lán)藻門（Cyanophyta） 2．細(xì)胞壁由上、下兩個(gè)硅質(zhì)瓣殼套合組成；殼面具輻射對(duì)稱或左右對(duì)稱的花紋………………………………………………………硅藻門（Bacillariophyta） 2．細(xì)胞壁沒有上、下兩個(gè)硅質(zhì)瓣殼組成……