【正文】 高密度富集[59]。本章利用10L自動生物發(fā)酵罐初步研究了啤酒酵母Y14產GSH的擴大發(fā)酵。 B流加培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖50，酵母膏 25，(NH4)2SO4 20，KH2PO4 ，MgSO4 ，水1000mL。每隔8h從發(fā)酵罐的取樣口中取出一定量的發(fā)酵液，測定其殘?zhí)菨舛?、菌體干重及GSH含量，并利用發(fā)酵罐的在線檢測，讀出發(fā)酵液pH值，將他們繪制成曲線。當20h時向發(fā)酵罐中加入L谷氨酸，L半胱氨酸，甘氨酸，ATP后，溶氧濃度迅速上升至100%，并維持此濃度至發(fā)酵結束。 補料培養(yǎng)進程曲線繪制，綜合上述一批發(fā)酵罐培養(yǎng)實驗結果分析如下：在發(fā)酵初期階段，殘?zhí)菨舛认陆岛芸?，由于碳源的消耗殆盡，惡劣的環(huán)境會嚴重阻遏菌體的生長繁殖和菌體細胞的富集，從而目的產物也無法高效積累，故發(fā)酵液中GSH產量也會因此嚴重下降。 GSH含量曲線繪制，當36h加入補料培養(yǎng)基后，GSH含量明顯升高。比較發(fā)現，菌體干重、%、%。凝膠過濾層析是根據蛋白質分子大小差異進行分離的，凝膠過濾填料中含有大量微孔，只允許緩沖液及小分子量蛋白質通過，而大分子蛋白質及一些蛋白復合物則被阻擋在外。 主要材料98%GSHARSigma，武漢新銳生物有限公司TrisBR中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司大孔樹脂D001BR武大弘源氨基酸廠提供SephadexG10BRSigma，武漢新銳生物有限公司DTNBARSigma，武漢新銳生物有限公司分裝 主要設備BSZ100自動部分收集器上海滬西分析儀器廠HD2000核酸蛋白檢測儀上海嘉鵬科學儀器有限公司25cm玻璃層析柱武漢華順科技實業(yè)有限公司50cm玻璃層析柱武漢華順科技實業(yè)有限公司305711便攜式記錄儀重慶川儀四廠 方法 GSH提取液的制備[65]將發(fā)酵后的啤酒酵母Y14細胞，水浴鍋中恒溫60℃，2h，8000r/min離心15min，得GSH抽提液。(3) 、。(3) 將GSH最佳濃度、最佳pH上樣后，、。(3) 上樣與洗滌完畢后，分別用pH=、%NaCl、1mol/LNaOH、% HCl + 。計算GSH吸附率、損失率、洗脫率，回收率、PRO去除率等結果。(3) DTNB法分別測量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測洗脫液中PRO含量。(3) DTNB法分別測量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測洗脫液中PRO含量，得實驗結果平均值。(3) DTNB法分別測量各柱洗脫液GSH含量，雙縮脲法檢測洗脫液中PRO含量，得實驗結果平均值。將處理好的D001樹脂裝入柱中，柱床高度為25cm。將處理好的SephadexG10裝入柱中，柱床高度為25cm。將處理好的D001樹脂裝入柱中，柱床高度為25cm。將處理好的D001樹脂裝入柱中，柱床高度為50cm。(1) 準備5支小層析柱，編號為x1x1xx2x22。 GSH上樣流速的選擇試驗(1) 準備4支小層析柱，編號為xx1x1x13 。 GSH上樣pH的選擇試驗(1) 準備6支小層析柱，編號為xxxxxx6 。目前未見文獻報道。經過D001分離后的GSH粗品中還含有蛋白質、氨基酸、核苷酸等物質，要得到較高純度的GSH產品，還要防止GSH被氧化失活，其難度大、成本高。 結論(1) 第一批自動生物發(fā)酵罐補料培養(yǎng)采用恒速流加單一葡萄糖培養(yǎng)基，20h時添加前體氨基酸和ATP的方法，測得GSH的產量在52h時，產量達到最大值243mg/L。 殘?zhí)乔€繪制 菌體干重曲線繪制二批發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體，由于全料流加培養(yǎng)基的加入和避免在20h時前體氨基酸和ATP的加入，0～，%。 GSH含量曲線繪制當菌體培養(yǎng)20h發(fā)酵罐補加前體氨基酸和ATP后，菌體細胞中GSH含量呈明顯上升趨勢且在培養(yǎng)時間達到52h時，細胞內GSH含量達到最大值。 結果與討論 第一批發(fā)酵罐補料培養(yǎng) pH曲線繪制，0～，隨著發(fā)酵時間的延長，隨后保持恒定。 (2)培養(yǎng)溫度恒定為30℃。 補料培養(yǎng)基L谷氨酸10mmol/L，甘氨酸6mmol/L，L半胱氨酸10mmol/L，ATP 。經過大量的試驗表明，微生物的補料培養(yǎng)是提高菌體生物量和GSH產量的較好辦法，補料培養(yǎng)成功的關鍵是補料策略的選擇，也就是根據生產的生長特點確定合理的補料時間，從而使發(fā)酵液中生物量大量積累。 結論啤酒酵母Y14產GSH的最適發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度30℃、搖床轉速180rpm、搖瓶裝液量30mL/300mL、補料培養(yǎng)基添加時間20h；最佳培養(yǎng)基組成是：葡萄糖20g/L, 酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 8g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4 ，在此試驗條件下，目前為國內所查文獻報道最高水平（陜西省微生物研究所詹谷宇[27]等篩得的突變株KllUE 126，是國內所查文獻報道最高水平，Kono[28]%，為目前國外文獻報道中GSH含量最高水平。 發(fā)酵搖瓶裝液量的優(yōu)選試驗結果 改變搖瓶裝液量會影響發(fā)酵液的溶氧濃度，從而影響菌體對GSH的積累。此時。 發(fā)酵初始pH的優(yōu)選試驗在其他發(fā)酵條件不變時，、7時，啤酒酵母Y14產GSH所得到的細胞干重、胞內GSH含量、發(fā)酵液中GSH產量。 培養(yǎng)基： 斜面培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 20，蛋白胨 20，酵母膏 5，瓊脂20。pH影響細胞對營養(yǎng)成分的吸收及代謝途徑，從而影響細胞生長及GSH積累?？梢娫撃Ｐ湍茌^好預測發(fā)酵所產GSH產量。 BoxBehnken試驗因素與水平 The factors and levels of variables used in BoxBehnken design試驗因素代碼編碼水平/(g/L)10+1葡萄糖X1102030酵母膏X251015(NH4) 2SO4X34810 BoxBehnken試驗設計和試驗結果 Experimental design and results of BoxBehnken 試驗編號X1X2X3Y**111021103110411050116011701180119101101011110112101130001400015000采用國際權威的SAS軟件回歸擬合表試驗數據，可以得到二階經驗模型為Y=+X1+X1X1X2X3X3式中，Y代表GSH產量，XXX3分別代表培養(yǎng)基中葡萄糖、酵母膏和(NH4) 2SO4的濃度(g/L)。試驗數據均用SAS (version9. 0 , SAS Institute Ine , Cary , NC ,USA) 處理分析。 DTNB法檢測GSH含量[49]取樣液2mL，反應數分鐘后顯色穩(wěn)定后于412nm處用分光光度計測定OD值。 培養(yǎng)基： 斜面培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 20，蛋白胨 20，酵母膏 5，瓊脂20。GSH產量（mg/L）=GSH含量（mg/g） 生物量（g/L）第2章 啤酒酵母Y14發(fā)酵GSH培養(yǎng)基的優(yōu)化生產GSH的酵母大都是工業(yè)常用菌株，這些菌株能在寬松的培養(yǎng)條件下生長并積累GSH，但產量往往很低。 目的研究目的：在本實驗室前期研究的基礎上，用實驗室現有的富含GSH的啤酒酵母Y14進行發(fā)酵生產GSH工藝的優(yōu)化及放大試驗、采用離子交換法及凝膠雙柱精制GSH的方法，最終達到提高GSH的回收率及產品質量的目的。梅樂和等選用環(huán)氧乙烷環(huán)氧丙烷無規(guī)共聚物(EOPO)/羥丙基淀粉(PES)雙水相系統，在EOPO4000 13%，PES100 10%，結合溫度誘導相分離技術從酵母細胞中提取GSH，GSH的總萃取率達80%以上，但因雙水相組成系統一般比較昂貴，此法目前還處于實驗室研究階段。趙睿，王滿意等[44]利用大孔苯乙烯樹脂改性合成含硫樹脂，考察了修飾條件對GSH吸附的影響，并對其在GSH分離中的應用進行了研究。經過48h的指數流加培養(yǎng)。結果表明，當葡萄糖濃度為30g/L且通氣量控制在5L/min時，攪拌轉速達到300 r/min，即可滿足細胞生長和GSH合成對溶解氧的需求。經培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件優(yōu)化后GSH ，GSH 。應用計算得出的一種以控制比生長速率為目的的搖瓶補糖策略。Chi Hsien等[30]認為葡萄糖是啤酒酵母()生長的最佳碳源，蛋白胨是最佳氮源。一、菌種選育%，但有一些酵母菌，如Saccharomyces glyoxalphilus、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)和 Saccharomyces cystinovolens、 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其菌體內GSH含量較高，且能長時間保持合成GSH的能力[17]。其中發(fā)酵法是最具潛力的方法。(4) 可以防止皮膚黑色素沉積，防止新的黑色素形成并減少其氧化[20]。GSH分子中含有一個特異的γ肽鍵，由谷氨酸的γ羧基與半胱氨酸的α氨基縮合而成，并且半胱氨酸側鏈基團上連有一個活潑巰基，是GSH許多重要生理功能的結構基礎。二甲基甲酰胺，但微溶于醇、醚和丙酮等有機溶劑。如果人體免疫能力強，就算被感染上病毒，也會將病毒的侵害降低到最低限度。%，%。本文以富含GSH的啤酒酵母Y14為材料，分別從以下四個方面進行研究：(1) 利用PlackettBurman 試驗設計、BoxBehnken試驗設計法對啤酒酵母Y14產GSH培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得到的最適培養(yǎng)基配方為: 葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 8g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4 。在此條件下，較原來提高了102%。最后SephadexG10分級分離純化GSH，50cm玻璃層析柱，最適上樣體積為2mL，%，%。其化學名為γL谷氨酰半胱氨酸甘氨酸[3](英文名：γLglutamylcysteinylglycine，簡寫為GSH)，其結構式如圖1所示： GSH的化學結構式圖 Chemical structural of glutathione1888年Pailbode首先發(fā)現GSH，1921年Hopkins[4]從酵母抽提物和動物肝臟中首先分離得到GSH結晶并命名，1929年Hopkins、Kendall等提出GSH為三肽并初步提出它的結構，1935年由Harington和Mead闡明其化學結構并加以化學合成[5]，隨后在1936年被Du Vigneaud和Miller驗證[6]，1938年利用酵母制備GSH的最早專利發(fā)表。通常人們所指的谷胱甘肽是還原型谷胱甘肽，GSH固體較為穩(wěn)定，但其水溶液在空氣中極易被氧化成GSSH。GSH強大的還原作用使肝細胞膜對氧自由基的耐受性增加，從而使GSH具有促進肝功能，保護肝細胞膜，提高肝臟酶的活性，加快黃疸的消退，增強肝臟解毒等功能，可用于輔助治療重型病毒性肝炎、肝硬化、非酒精性脂肪肝，對藥物性腎和肝損害也有保護作用[17]。(6) 其他功能。自1938年實現了由酵母制備GSH以來，發(fā)酵法生產GSH 的工藝及方法不斷得到改進，且發(fā)酵使用的細菌或酵母容易培養(yǎng)，原料容易獲得，條件容易控制，因此發(fā)酵法已成為目前生產GSH最普遍的方法。 陜西省微生物研究所詹谷宇等[27]在酵母菌的誘變育種中用GSH的代謝類似物乙硫氨酸作為抗性篩選物，篩得抗代謝類似物突變株KllUE 126，%，這是我國目前通過常規(guī)誘變方法獲得的GSH含量最高的菌株。GSH的產量和含量在葡萄糖初始濃度為30g/L時達到最高。時麗萍，郭學武等[32]分別考察了有機和無機氮源對酵母積累GSH的影響，結果顯示，酵母粉為最合適的有機氮源，可能是因為酵母粉中含有多種生長因子和氨基酸，能夠促進細胞的生長和GSH的合成。Alfafara[36]等研究了半胱氨酸的補加策略，實驗結果表明，連續(xù)流加后期，細胞比生長速率和GSH比生產速率皆下降，整個發(fā)酵過程中GSH含量與不加半胱氨酸相比，無顯著提高；而一次性補加半胱氨酸可以很大程度上提高GSH的比生產速率。同時研究了24～32℃范圍內產朊假絲酵母生產GSH的分批發(fā)酵過程，發(fā)現較高溫度(30℃)對細胞生長有促進作用，而較低溫度(26℃)則更有利于GSH產量的提高。蔡俊，邱雁臨[42]對使用732陽離子交換樹脂法提取GSH時的提取條件進行了研究，洗脫流速30cm/min， %，%。采用真實發(fā)酵液進行分離純化，收率為35%。在化妝品領域中，它有抗衰老、增白、祛斑等作用。將上述最佳試驗條件運用到10L發(fā)酵罐發(fā)酵生產GSH的擴大重復試驗當中，以確定最有利于工業(yè)生產的試驗方案。一些試驗設計(如正交試驗設計、因次分析設計、中心復合試驗設計等)及數據處理方法(如PlackettBurman試驗設計、響應面分析、神經網絡模型)的應用可以減少工作量并且使試驗結果具有更高的可信度和實際應用價值。 主要試劑葡萄糖AR廣州化學試劑廠蛋白胨BR國藥集團化學試劑有限公司牛肉浸膏BR上海長陽生化制藥廠(NH4)2SO4AR北京益利精細化學品有限公司MgSO4每個因素取3個水平，在中心點上有3個重復。 PlackettBurman 設計試驗的的回歸系數及其顯著性檢驗Tab Regression coefficients and their significance test of PlackettBurman design EffectEstimat