【正文】 常用于蛋白質(zhì)等生物分子離子交換的陰離子交換基有： DEAE(二乙胺乙基，適用范圍 pH＜ ； QAE(季銨乙基 )。 線性梯度洗脫過程中，流動(dòng)相的離子強(qiáng)度線性增大，因此溶質(zhì)分配系數(shù)連續(xù)降低，移動(dòng)速度逐漸增大，使恒定洗脫條件下難于洗脫的溶質(zhì) B在較小的流動(dòng)相體積下洗脫。 親和色譜操作示意圖 (● 目標(biāo)產(chǎn)物， ?雜蛋白 ) 根據(jù)選擇性的高低，可將親和色譜分為 專一性 和 基團(tuán)性 兩類。 親和色譜載體 國(guó)際知名牌號(hào)的親和色譜載體基質(zhì)： 美國(guó) Amicon公司的 Matrex CellufineTM(交聯(lián)纖維系 ) 法國(guó) IBF公司的 UltrogelR(聚丙烯酰胺／瓊脂糖 ) 英國(guó) Shandon公司的 Hyperil WP300TM(硅 ) 日本東洋曹達(dá)公司的 Toyopearl， 等等 載體基質(zhì)的特性對(duì)分離純化效果至關(guān)重要。 與其他色譜分離一樣，可通過改變?nèi)軇┗蚓彌_液的類型，改變緩沖液的 pH和離子強(qiáng)度，改變洗脫溫度，以及添加促溶劑等措施進(jìn)行洗脫。 高效液相色譜儀 Fermentation Culture supernatant Centrifugation to remove cells Liquid preparation to animal feed market Fermentation Culture supernatant Fermentation Cell pellet Intracellular fraction Animal feed enzyme Analytical enzyme Therapeutic protein Centrifugation to remove cells Centrifugation to remove medium Protein precipitation Cell lysis amp。 ②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。 親和色譜中引入 “ 手臂 ” 原理 親和色譜一般采用柱色譜法。 親和色譜所用固定相載體是由對(duì)生化物質(zhì)有特異親和力的配位體偶聯(lián)在惰性載體上構(gòu)成。 其顯著特點(diǎn)是 高選擇性 ，且色譜過程操作條件溫和，能有效地保持生物大分子高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，活性樣品的回收率也比較高。 如果采用離子強(qiáng)度不變的流動(dòng)相進(jìn)行恒定洗脫，兩種蛋白質(zhì)的洗脫體積相差很大，甚至分配系數(shù)大的蛋白質(zhì)很難洗脫，造成洗脫劑的大量消耗和洗脫時(shí)間的大幅度增加。 荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)可用下式表示： ??? ，dBd KIAIK )(其中， I為流動(dòng)相的離子強(qiáng)度， A和 B為常數(shù)， Kd,∞ 為離子強(qiáng)度無限大時(shí)溶質(zhì)的分配系數(shù)，是靜電相互作用以外的非特異性吸附引起的溶質(zhì)在離子交換劑上的分配。 1．分離純化 GFC用于相對(duì)分子質(zhì)量從幾百到 106數(shù)量級(jí)的物質(zhì)的分離純化，在蛋由質(zhì)、肽、脂質(zhì)、抗生素、糖類、核酸以及病毒 (50400nm)的分離與分析中頻繁使用。 交聯(lián)葡聚糖凝膠骨架結(jié)構(gòu) 瓊脂糖凝膠的骨架結(jié)構(gòu) Sephadex G是利用葡聚糖 (右旋糖酐 )交聯(lián)制備的，交聯(lián)劑一般采用環(huán)氧氯丙烷 (epichlorohydrin)。 RPC中溶質(zhì)通過疏水性相互作用分配于固定相表面。要維持產(chǎn)物純度，需要待處理物料中各組分的色譜濃度分布不能有大的改變。降低流速意味著增加分離時(shí)間，因此采用減小粒徑的方法可同時(shí)保證分離操作的高速度和高精度，很短的色譜柱具有很大的 N，對(duì)高速度、高精度的分離有利。 ε —— 固定相空隙率 積分式 (748)，可得使洗脫液從 C0降至 C所需的固定相填充柱長(zhǎng)為： (750) ?? ???CCLCCdCkaudzL0*0)(HNL ??(7 51) kauH ?(753) (752) 通過對(duì)實(shí)驗(yàn)用色譜柱的測(cè)定，可確定 L之值；從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可求得傳質(zhì)單元數(shù)的近似值。此時(shí)，輸入與流出的組成完全相同。 (3) 梯度洗脫法 梯度洗脫法就是逐漸改變洗脫劑的組成，使洗脫條件更有利于混合物的分離，從而消除重疊峰現(xiàn)象。 (一 )樣品溶解與進(jìn)樣方法 柱色譜操作技術(shù) 樣品上柱后，加入洗脫劑，使樣品分離并收集目的產(chǎn)物。 柱色譜分離法裝置 柱色譜裝置 (一 )進(jìn)樣及流動(dòng)相供給裝置 (二 )色譜柱 柱的分離效率與柱長(zhǎng)成正比，與柱徑成反比。 纖維素及其眾多的衍生物已被廣泛地用于蛋白質(zhì)類物質(zhì)的純化。 1．瓊脂糖 (Agarose) 2．葡聚糖 (Dextran) 葡聚糖 (Dextran)是 α1， 6鍵相連的葡萄糖聚合物。以自由硅羥基對(duì)各種鍵合反應(yīng)最為重要。 溶質(zhì)分子充滿色譜柱的體積，也即洗脫容積為： idoe VKVV ??或 ioed VVVK ??Kd＝ 1，溶質(zhì)分子完全不被排阻， 可自由進(jìn)入所有凝膠顆粒微孔。 (701) msd ccK ? cs、 c m分別為溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的濃度， Kd為分配系數(shù)。但電泳法目前尚不能用于生產(chǎn)規(guī)模的分離與純化，因而 色譜技術(shù) 成為分離和純化蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖等生物大分子物質(zhì)的 核心手段 。 把與目的產(chǎn)物具有特異親和力 的生物分子固定化后作為固定相，則當(dāng)含有目的產(chǎn)物的混合物 (流動(dòng)相 )流經(jīng)此固定相時(shí)，即可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來。 (二 )分配色譜 (Distribution Chromatography， DC) 離子交換色譜是基于 離子交換樹脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換 ，由于混合物中不同溶質(zhì)對(duì)交換劑具有不同的結(jié)合力而將其分離。 (4)高靈敏度的在線檢測(cè) (5)快速分離 高效細(xì)顆粒固定相載體和高壓液相色譜分離技術(shù)的采用，保證在高分離效率前提下的高分離速率，可以提高單位時(shí)間的產(chǎn)量。 1944年 出現(xiàn)紙層析 。 色譜分離基本特點(diǎn) (1)分離效率高 是所有分離純化技術(shù)中最高的 (不計(jì)電泳 )。 吸附色譜是指混合物隨流動(dòng)相通過固定相吸附劑時(shí)， 由于固定相對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物分離 。 (三 )離子交換色譜 (Ion Exchange Chromatography， IEC) (四 )凝膠色譜 (Gel Chromatography， GC) 凝膠色譜以凝膠為固定相，是一種 根據(jù)各物質(zhì)分子大小不同而進(jìn)行分離 的色譜技術(shù) 。 除用于分析外，還廣泛用于生物樣品的制備和工業(yè)生物產(chǎn)品的分離與純化 。 其中 ， 氨基酸 、 有機(jī)酸 、 核苷酸等一些離子型化合物的生產(chǎn)多用 離子交換色譜分離 ；而抗生素 、 生物堿 、 萜類 、 色素等次級(jí)代謝產(chǎn)物多采用 吸附色譜 或 反相分配色譜 分離 。 在一定溫度下 ， 分離物質(zhì)在液相和固相中的濃度關(guān)系可用吸附方程式來表示： (714) adKKA B A B?????? ??BBB)(A c1accb??(715) A－吸附劑 ， B－游離在液相中的溶質(zhì) ， A—B表示吸附劑與溶質(zhì)的結(jié)合方式 。 當(dāng)具有不同分子量物質(zhì)的混合液流經(jīng)凝膠柱時(shí)，其 Kd值的大小就決定了物質(zhì)的流出順序，即 Kd值小的先流出， Kd值大的后流出。但活性炭生產(chǎn)原料