目的基因的獲取ppt課件(存儲版)
【正文】 子，從而激活 UAS（上游激活序列）下游啟動子調(diào)節(jié)的報(bào)告基因的表達(dá)。端錨定脫氧核苷酸引物，并用 539。根據(jù)一些已知的與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記可以獲得目的基因。 ? 重組克隆總數(shù)不可過大； ? 克隆基因的完整性； ? 部分重疊序列大小合適； ? 克隆片段易于從載體上卸載； ? 重組克隆能穩(wěn)定保存擴(kuò)增篩選。 N端 C端 氨基酸序列： Val Phe Asn Ala Trp Lys Asp His 核苷酸序列 :GTNTT(T/C)AA(T/C)GCNTGGAA(A/G)GA(T/C)CA(T/C) 引物 1 引物 2 簡并引物 1： GTNTT(T/C)AA(T/C)GCNTGGAA 共 16種 簡并引物 2： GCNTGGAA(A/G)GA(T/C)CA 共 16種 反義引物： oligo（ dT） 1218 已知序列 mRNA 5’ AAAAAA3’ TTTTTTT5’(反義引物 ) 逆轉(zhuǎn)錄 mRNA 5’ AAAAAA3’ TTTTTTT5’(反義引物 ) 加入簡并引物 變性、退火、延伸 TTTTTTTT5’ 引物 1 AAAAAAA3’ 加入簡并引物 變性、退火、延伸 AAAAAAA3’ TTTTTTTT5’ 四、依據(jù)基因部分序列信息獲得基因全長序列 反向 PCR (inverse PCR, IPCR) 盒式 PCR RACE技術(shù) ? 反向 PCR：根據(jù)已知 DNA區(qū)的序列設(shè)計(jì)引物，以包含已知區(qū)和未知區(qū)的環(huán)化 DNA分子為模板來擴(kuò)增未知DNA區(qū)序列的 PCR技術(shù)。 pUC11 119是 —— 載體。 可以去除 DNA片段中突出的單鏈尾巴。 ?應(yīng)用范圍： 1）合成 PCR引物 2）寡核苷酸探針 3）人工接頭 4）較小的基因 固相亞磷酸三酯法 一、基本原理 二、支持物 可控微孔玻璃珠（ CPG） 三、單體 ? 3’位 二異丙基亞磷酸酰上的磷酸的羥基用甲基或 β 氰乙基保護(hù) ? 5’位 二甲氧基三苯甲基 （ DMT） OHGHH HHOCH2OD M TPOMeNCHMeMeCHMeMe四、反應(yīng)步驟 ? 第一步 核苷酸單體 1的去封閉（ Deblocking） 去除 CPG所連核苷上的 DMT，以暴露 5’羥基 ? 第二步 核苷酸單體 2的活化（ Activation） 形成亞磷酰胺四唑這種活性中間體 ? 第三步 連接（ Coupling） 亞磷酰胺四
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