【正文】 擇）。 FCM是隨著計(jì)算機(jī)科學(xué)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、單克隆抗體制備、定量細(xì)胞化學(xué)和定量熒光細(xì)胞化學(xué)等方法和技術(shù)的應(yīng)用而日益完善的，其檢測(cè)分析對(duì)象范圍越來越大，如大的免疫復(fù)合物、病毒、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、原核細(xì)胞、真核細(xì)胞以及某些簡(jiǎn)單的多細(xì)胞生物，而且對(duì)所有生物都普遍適用，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的幾乎所有分支學(xué)科，特別是細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)、藥物學(xué)等的研究。 反復(fù)植塊法的 優(yōu)點(diǎn) 在于以動(dòng)物組織植塊為材料，細(xì)胞在取材過程中受損傷的程度低。 針對(duì)不同的研究目的，需要對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行純化，以獲得成分相對(duì)單純的培養(yǎng)物。 細(xì)胞系 是由原先組成原代培養(yǎng)物的所有細(xì)胞類型所組成。有的無限細(xì)胞系不僅有永生性，異體接種也有致瘤性，說明其已惡性化，可稱之為惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系 (malignant transformed cell line）。 克隆 作為 名詞 使用，是指從一個(gè)單一母細(xì)胞繁殖出來的細(xì)胞群體。 適應(yīng)性和活力較強(qiáng)的細(xì)胞能增殖形成細(xì)胞小群落。 ③ 待克隆細(xì)胞：經(jīng)過原代或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。在細(xì)胞克隆中，用膠原膜層或血纖維膜層代替飼養(yǎng)細(xì)胞，可幫助單個(gè)細(xì)胞和密度極低的分散細(xì)胞黏附和貼壁、存活并逐漸繁殖。 ④ 觀察并計(jì)數(shù)克隆之?dāng)?shù)目。 ④取完全培養(yǎng)液和 2%瓊脂液配成含有 % 瓊脂的培養(yǎng)液。 ④培養(yǎng) 1～ 2d觀察結(jié)果，計(jì)克隆數(shù)。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 克隆化培養(yǎng)液 培養(yǎng)基名稱 應(yīng)用 培養(yǎng)基名稱 應(yīng)用 Eagle MEM Ham 培養(yǎng)液 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （ 2）培養(yǎng)基 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 3）血清 胎牛血清 作培養(yǎng)液中的血清成分，比 小牛血清 優(yōu)越。地塞米松也能提高人正常膠質(zhì)細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞等的克隆形成率。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 7）適應(yīng)性生長(zhǎng)基質(zhì) 不同細(xì)胞適于在不同的生長(zhǎng)基質(zhì)上生長(zhǎng)。因此，必須人為地給細(xì)胞群落創(chuàng)建一個(gè)隔離環(huán)境，便于進(jìn)一步分離。 常用的方法有三種： （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） OVER 。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 克隆的分離 細(xì)胞克隆形成后，須將克隆分離出來并進(jìn)行繁殖。 例如，無限細(xì)胞系易貼附于塑料瓶壁上，原代培養(yǎng)的細(xì)胞易貼附于膠原層或血漿纖維蛋白層生長(zhǎng)基質(zhì)上。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 5）激素和生長(zhǎng)因子 一些激素和生長(zhǎng)因子可促進(jìn)細(xì)胞克隆的形成。 其中 Ham培養(yǎng)液 和 F12K 培養(yǎng)液被證明是最好的克隆化培養(yǎng)液 ,適用于許多細(xì)胞類型。 ③放置于 4℃ 條件下使其凝固。 ②準(zhǔn)備進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，將 2％瓊脂母液加熱融 化后，在室溫下降溫，然后浸人 45℃ 水 浴中。 ③ 將細(xì)胞懸液按所需數(shù)目種入鋪有生物基質(zhì)層的 培養(yǎng)器皿內(nèi)，于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 但作為生長(zhǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)某些難培養(yǎng)的細(xì)胞尚有應(yīng)用價(jià)值。 （ 1）稀釋鋪板法 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 克隆培養(yǎng)技術(shù) （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 1）主要實(shí)驗(yàn)材料： ① 培養(yǎng)用液：培養(yǎng)液、消化酶溶液、平衡鹽溶液。但實(shí)際上， 原代培養(yǎng)細(xì)胞 和 有限細(xì)胞系 （二倍體細(xì)胞）比較困難， 無限細(xì)胞系 、 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系 和 腫瘤細(xì)胞 則比較容易。 其實(shí)，這兩個(gè)概念有明顯的區(qū)別， 細(xì)胞株 （ cell strain）強(qiáng)調(diào)培養(yǎng)物細(xì)胞成分的單一性，所有細(xì)胞的遺傳、生化等特性完全相同； 細(xì)胞系 （ cell line） 雖然并不強(qiáng)調(diào)細(xì)胞的純度，可以包含多種細(xì)胞成分，但主類細(xì)胞應(yīng)占絕大多數(shù)。 連續(xù)細(xì)胞系多為異倍體細(xì)胞。如果對(duì)原代培養(yǎng)物進(jìn)行傳代培養(yǎng)，此時(shí)的培養(yǎng)物就稱為 細(xì)胞系（ cell line） 。于是，培養(yǎng)物中留下相對(duì)較純的有絲分裂后細(xì)胞。 ： 反復(fù)植塊法 (repeated explantation)主要是利用不同細(xì)胞的遷移能力不同，在植塊培養(yǎng)不同時(shí)間后，待遷移能力強(qiáng)的細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞）從植塊遷移出來以后，而將植塊重新種植，使目的細(xì)胞再遷移出來，收獲并用于進(jìn)一步培養(yǎng)。 ： 某些細(xì)胞如人 T淋巴細(xì)胞具有異種紅細(xì)胞的受體，在一定的條件下，T淋巴細(xì)胞可與紅細(xì)胞相互識(shí)別而結(jié)合，形成一個(gè) T淋巴細(xì)胞被數(shù)個(gè)紅細(xì)胞圍繞的現(xiàn)象，在顯微鏡下觀察宛如一支玫瑰花，故形象地稱為玫瑰花環(huán) (rosette)。 當(dāng)補(bǔ)體存在時(shí) ，用抗細(xì)胞某一表面標(biāo)志的特異性抗體與異質(zhì)性細(xì)胞一起孵育，可以使具有該特異性表面標(biāo)志的細(xì)胞溶解。在此情況下，單核／巨噬細(xì)胞可吞噬鐵粒子，這一特性也有助于將其清除。 差速黏附處理 常用于分離 細(xì)胞懸液中的 成纖維細(xì)胞 與其它組織細(xì)胞。其不足之處是分離方法還不太理想，重復(fù)性較差，設(shè)備復(fù)雜且價(jià)格昂貴，故一直未能推廣應(yīng)用。 在生理 pH條件下，絕大多數(shù)細(xì)胞帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中將向正極泳動(dòng)，但不同細(xì)胞所帶負(fù)電荷密度不同，故在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度不同，據(jù)此可將不同類型的細(xì)胞分離開。 應(yīng)用本技術(shù)分離細(xì)胞常用的梯度介質(zhì)有 BSA和 Percoll。 等密度梯度離心法分離細(xì)胞的 依據(jù) 是細(xì)胞的 密度 。 國(guó)內(nèi)常用造影劑泛影葡胺（ meglumini diatrizoici）代替，其商品名為 Urografin,含量通常為 60%或 75%,其與 Ficoll配制的溶液商品名是淋巴細(xì)胞分離液（上海試劑二廠），密度 ，主要用于人單個(gè)核細(xì)胞的分離。因此，實(shí)施沉降技術(shù)分離純化細(xì)胞的 關(guān)鍵在于 選擇 密度梯度形成介質(zhì) ，故沉降技術(shù)也稱為 密度梯度（離心）技術(shù) 。 1) 機(jī)械刮除法： 2）選擇性酶消化法： （散）組織制備細(xì)胞懸液過程中的細(xì)胞分離 細(xì)胞可視為一種完整的顆粒并且表現(xiàn)出與此有關(guān)的 物理性狀 。準(zhǔn)確的取材是獲得某一特定培養(yǎng)對(duì)象的 關(guān)鍵 。 為了獲得大量細(xì)胞培養(yǎng)物，必須將組織解離，將組織塊內(nèi)部細(xì)胞與細(xì)胞之間的“組織關(guān)系”解除，將細(xì)胞“解放”，使之成為分離（離散）的細(xì)胞，這個(gè)過程即為 細(xì)胞分離（離散） 或 分散（ cell dissociation)。 培養(yǎng)物中細(xì)胞成分是否單一或者 目的細(xì)胞 在培養(yǎng)物中的比例如何，常常是衡量某一培養(yǎng)工作是否成功的 重要指標(biāo) 。 在進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，不僅要將擬培養(yǎng)組織材料制備成 分離（離散）的細(xì)胞（ dissociated cell）， 以細(xì)胞懸液的形式接種并培養(yǎng)，更重要的是從所制備的細(xì)胞懸液中 分離(separation or isolation)出成分盡可能單一的細(xì)胞用于培養(yǎng)。 而進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)的目的，不外乎研究特定細(xì)胞的特性、功能或其它特殊用途，故一般必須獲取分離開的和盡可能均一的細(xì)胞群體。 分離和純化細(xì)胞的過程不僅僅是在原代培養(yǎng)之前進(jìn)行，有時(shí)候，分離和純化細(xì)胞的過程還貫穿在原代與繼代培養(yǎng)的過程之中，甚至主要依靠培養(yǎng)過程實(shí)現(xiàn)分離與純化細(xì)胞的目的。大部分位于植塊內(nèi)部的細(xì)胞會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體滲透困難而缺乏營(yíng)養(yǎng)和 O2供應(yīng)，以致生長(zhǎng)發(fā)育不良或者死亡，這也是植塊培養(yǎng)法難以進(jìn)行長(zhǎng)期體外培養(yǎng)的 主要原因 。 （散）組織制備細(xì)胞懸液過程中的細(xì)胞分離 （ 1）取材 取材是整個(gè)體外培養(yǎng)過程的開始。 （ 4）培養(yǎng)過程中的選