cr引物設(shè)計及相關(guān)軟件使用(存儲版)
【正文】 反映 )，形成引物二聚體 (primer dimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（ duplex formation and hairpin）的能值 ?在錯配位點（ false priming site）的引發(fā)效率 ?引物及產(chǎn)物的 GC 含量（ position），等等。 5’端序列對 PCR 影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標(biāo)記物。 一般原則 7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使 PCR 反應(yīng)不能正常進行。 Tm 值的計算有多種方法，如按公式 Tm＝ 4(G+C)＋ 2(A+T)，在 Oligo 軟件中使用的是最鄰近法 (the nearest neighbor method) 。引物 3’端出現(xiàn) 3 個以上的連續(xù)堿基，如 GGG 或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。使用不合適的 PCR 引物容易導(dǎo)致實驗失?。罕憩F(xiàn)為擴增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等?，F(xiàn)在 PCR 引物設(shè)計大都通過計算機軟件進行。 一般原則 3’端的末位堿基對 Taq 酶的 DNA 合成效率有較大的影響。 一般原則 6. ?G 值是指 DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。引物的 3’端的 ?G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā) DNA 聚合反應(yīng)。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致 PCR 反應(yīng)失敗。 引物設(shè)計的原則 ?引物與模板的序列要緊密互補 ?引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu) ?引物不能在模板的非目的位點引發(fā) DNA 聚合反應(yīng) (即錯配 )。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化
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