【正文】 疫組化染色技術(shù)的分類 ? 免疫熒光法（ Immunofluorescence technique） ? 免疫酶法（ Immunoperoxidase technique） ? 免疫金銀法（（ Immunogold technique） ? ABC法（ AvidinBiotin Complex） 五 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù) 1 GST融合蛋白進(jìn)行 Pulldow實(shí)驗(yàn) （ 1）原理 細(xì)菌表達(dá)的谷胱甘肽 s－轉(zhuǎn)移酶（ GST）融合蛋白主要用于蛋白的親和純化，也可以將 GST融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結(jié)合，然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀 GST融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。C搖動(dòng) 1h ? 5）加入 ProteinGSepharose懸液， 4186。其檢測的原理類似于抗原、抗體檢測的 ELISA法。 3 酵母雙雜交系統(tǒng) 雙雜交系統(tǒng)的原理 LacZ Gal4激活域 Gal4結(jié)合域 Gal4結(jié)合域 LacZ LacZ Gal4激活域 LacZ Gal4激活域 Gal4結(jié)合域 X Y X Y 1） 已知蛋白之間相互作用的檢測： 2） 蛋白質(zhì)的功能域研究：通過對其中某一個(gè)蛋白質(zhì)作缺失或定點(diǎn)突變 ， 再用此系統(tǒng)檢測是否還存在相互作用 ， 可闡明其功能域或關(guān)鍵氨基酸； 3） 克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質(zhì)基因與 BD基因構(gòu)建成 “ 誘餌 ” 表達(dá)質(zhì)粒 ， 將某一器官或組織的 cDNA文庫與 AD基因構(gòu)建成 “ 獵物 ” 基因庫 ， 共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞 ，可篩到與感興趣蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的 cDNA序列 ，并推測其蛋白質(zhì)序列 。如果用蛋白質(zhì) X的抗體免疫沉淀 X，那么與 X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì) Y也能沉淀下來。 ? 原理： ? 是指酶標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的成色反應(yīng) ， 對相應(yīng)的抗原進(jìn)行定性 、定位和定量測定的一項(xiàng)技術(shù) 。 （ 3）加入 PBST溶液， 37176。 3 爬片細(xì)胞染色：同上，最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。C反應(yīng) 3060min 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析。然后加入相應(yīng)抗原，繼而加入針對抗原特異的酶標(biāo)抗體，再與底物作用，顏色的深淺即與標(biāo)本中的 IgM含量成正相關(guān)。 ? 方法： 抗體包被 封閉 同時(shí)加入待測抗原和酶標(biāo)抗原 ? 洗滌 酶底物 顯色 ELISA reader檢測 ? 2）抗原固相測抗原 其原理是標(biāo)本中的抗原和固相抗原與一定量的抗體競爭結(jié)合。 方法： 抗原包被 封閉 待檢抗體 洗滌 酶標(biāo)二抗 洗滌 顯色反應(yīng) 終止反應(yīng) ELISA Reader檢測 OD值 (2) 雙抗體夾心法測抗原 ? 是檢測抗原最常用的方法。 二、 ELISA ELISA 常用的酶和底物 ? 辣根過氧化物酶，底物為 OPD, 深桔黃色 ，檢測波長 492nm ? TMB， 藍(lán)綠色，檢測波長 450nm 堿性磷酸酶，底物為 PNPP（對－消基苯磷酸酯） , 黃色 檢測波長 405nm ELISA各步驟的反應(yīng)時(shí)間 包被： 24－ 36h，蛋白濃度為 1－ 5ug/ml 封閉： 37186。一張膜可以重復(fù)使用 3－ 4次。 第二節(jié) 蛋白質(zhì)分析技術(shù) ? 講述內(nèi)容： 一 、 Western Blot 二 、 ELISA 三 、 免疫熒光技術(shù) 四 、 免疫組織化學(xué)技術(shù) 五 、 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù) 一 Western Blot ? 1 原理 ： ? 將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或 PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入標(biāo)記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進(jìn)行特異性蛋白的半定量。 ∴ 如果擴(kuò)增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整合適的 Mg2+濃度 （ 1）變性溫度： 9495℃ Templete： GC比例高、長度很長，則變性 T↑ （ 2）退火：溫度越高，擴(kuò)增特異性越好 取決于 Tm值： Tm↑ 退火 T↑ ； Tm↓ 退火 T↓ 若 Tm較高，可使退火和延伸在同一溫度 （ 3）延伸： ?500nt1min ?500nt－－ 3min 一般： 40－ 60sec ： （三） PCR技術(shù)的應(yīng)用 ? 1. 基因檢測： ? 2. 基因克隆化 ? 3. DNA突變 ? 4. DNA序列分析 四、基因芯片 ? 利用核酸雜交的原理，應(yīng)用于 DNA、 RNA的研究 背景資料 基因芯片（Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ）就是利用點(diǎn)樣機(jī)等機(jī)械裝置，在玻璃等支持物表面整齊地點(diǎn)上高密度的、成千上萬個(gè) “ 點(diǎn) ” ，每個(gè) “ 點(diǎn) ” 含有可與一種基因雜交的一條ＤＮＡ探針。 （ 2） Primer 本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補(bǔ)序列 形成 loop環(huán)，內(nèi)部二級結(jié)構(gòu) 如： GGGTCGATTCCTACCCATGC （ 3）注意減少 Primer間互補(bǔ)序列 導(dǎo)致 2個(gè) Primer形成 dimer 一般不要超過 3個(gè)互補(bǔ) bp 如： CCCATGC ATGGAGTC : : : : : : : : GGGTCTA TCAGTAAGC ? ? ? 修飾 ? 如： 32P、生物素、熒光素，不影響其效果 ? 突變： ? AGCTCCATGACCCAG ? 539。 ? 負(fù)鏈 339。 （ 1） 靠近 539。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。 1. 瓊脂糖凝膠用于分離大于 200～ 1000bp的片段 。 ? 用途：檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 （ mRNA）及其含量 。————— 339。→ 539。端進(jìn)行上述改造 ? ∵ DNA聚合酶是 539。由于核酸片段上已標(biāo)記有熒光素，激發(fā)后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度就與樣品中所含有的相應(yīng)核酸片段的量成正比，也就代表該基因的表達(dá)量。 濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致 ? 以適量的轉(zhuǎn)移 Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜 15－ 30min，如果是 PVDF膜，必須先用甲醇激活后浸泡。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反