【正文】 A，混合均勻后于 75℃加熱，間斷混合 (每23min)，直至凝膠塊完全熔化 (約 6 8min)。紫外分光光度計(jì)測(cè)定 RNA 在 260nm 和 280nm 處的光吸收值（ OD 值），確定 RNA 的純度及濃度，再根據(jù)其濃度計(jì)算 RNA 電泳加樣量， RNA 電泳加樣 35 ?g。 實(shí)驗(yàn)方法 兼并引物設(shè)計(jì) 利用 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)查找不同植物 NHX1 基因的氨基酸序列，比對(duì)同源性（ Clustal W），根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)兼并引物（ 其中 R=A/G,Y=C/T， M=A/C， K=G/T，S=C/G,W=A/T,H=A/C/T,B=C/G/T,=A/C/G,D=A/G/T,N=A/C/G/T）。 d1【 32】 。④表達(dá)水平與細(xì)胞周期及細(xì) 胞是否活化無(wú)關(guān) 。他們通過(guò)雙向電泳分析白 刺鹽脅迫蛋白，發(fā)現(xiàn)某些特異性表達(dá)蛋白在 其他耐鹽植物的研究中沒(méi)有被 發(fā)現(xiàn)，部分證明了可能存在不同于其他植物耐鹽性的機(jī)理，因此對(duì)鹽堿均有較高的耐受性 【 29】 。 自 1976 年分別首次在動(dòng)物老鼠腎細(xì)胞質(zhì)膜上和植物大麥質(zhì)膜上發(fā)現(xiàn) Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Xue 等 【 19】 在小麥中過(guò)量表達(dá) AtNHX1，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小麥在鹽土壤中谷粒產(chǎn)量提高，并且谷粒大而重。 Hamada 等 【 15】 從鹽生植物 濱藜 中克隆出 Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，命名 AgNHX1。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥 AtNHX1 啟動(dòng)子 GUS的分析結(jié)果 啟動(dòng)子區(qū)包含推測(cè)的 ABA 反應(yīng)元件 (ABRE)，位于起始密碼的736728 之間， ABRE 元件存在于不同物種對(duì) ABA 應(yīng)答的基因中。；二是 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 的 C 末端 對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)活性和離子選擇性的調(diào)控， 植物液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的 C 末端比質(zhì)膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的 C 末端短得多，僅有 100 多個(gè)氨基酸。 AtNHX1 的 TM3 區(qū)具有一個(gè)推測(cè)的氨氯吡嗪脒結(jié)合序列(FFIYLLPPI)，這段序列在其他植物 NHX 以及哺乳動(dòng)物 NHE 中均高度保守，氨氯吡嗪脒與真核生物 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合后能抑制其轉(zhuǎn)運(yùn)活性。這六個(gè)成員具有器官和鹽處理特異性的表達(dá)模式。 液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 （ NHX） 研究進(jìn)展 液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子特征 植物胞內(nèi) NHX 家族 分為兩類(lèi)，分別用符號(hào) I 和 II 表示。嚴(yán)重阻礙植物生長(zhǎng)發(fā)育，已成為鹽堿地區(qū)限制作物產(chǎn)量的主要因素 【 1】 。另外，本研究還克隆了小果白刺的 肌 動(dòng)蛋白基因 片斷。學(xué)校代碼 10126 學(xué)號(hào) 00611049 分 類(lèi) 號(hào) 密級(jí) 本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 白刺 液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及 肌動(dòng)蛋白基因 的 克隆與 基因 序列分析 學(xué)院、系 生命科學(xué)學(xué)院生物系 專(zhuān)業(yè)名稱(chēng) 生物科學(xué) 年 級(jí) 2021 級(jí) 學(xué)生姓名 王麗 指導(dǎo)教師 林曉飛 2021 年 6 月 1 日 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計(jì) ) 白刺 液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及 肌動(dòng)蛋白基因 的 克隆與 基因 序列分析 摘要 白 刺屬（ Nitraria L.）是蒺藜科 (Zygophyllaceae)的古老小屬，中國(guó)有 8 種，內(nèi)蒙古有 4 種該屬植物是我國(guó)內(nèi)蒙古、甘肅和新疆一帶荒漠植被的重要建群種之一，為 耐 干旱、耐鹽堿、抗風(fēng)蝕沙埋、生長(zhǎng)快、易繁殖的優(yōu)良防風(fēng)固沙先鋒植物，而且 具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，因此 開(kāi)發(fā)其抗逆性基因資源、 從分子生物學(xué)角度探討耐鹽機(jī)理具有重要的理論意義 。 本研究 以開(kāi)發(fā)白刺的耐鹽基因資源、揭示其耐鹽分子機(jī)理為目的、 利用RTPCR、 RACE 技術(shù)及 iPCR 的方法，從小果白刺 (N. sibirica Pall)中 克隆了 NHX cDNA 片斷 ， 并對(duì)其進(jìn)行了 經(jīng)過(guò)同源序列比較及進(jìn)化關(guān)系分析 ，從而為調(diào)查該基因的表達(dá)調(diào)控模式、作用機(jī)理及利用該基因進(jìn)行甜土植物的耐鹽性遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。我國(guó)鹽漬化土壤主要分布于北方和沿海地區(qū)，鹽漬化使土壤水勢(shì)下降。四是合成保護(hù)蛋白，又稱(chēng)滲透脅迫蛋白 【 4】 。 Zorb 等 【 6】 克隆了玉米 (Zea mays L.)NHX 家族的六個(gè)成員 ZmNHX1~6，其中， ZmNHX1， 2， 6 屬于一個(gè)亞家族，與擬南芥 AtNHX1， 2 同源性高，而ZmNHX3， 4， 5 屬于另一個(gè)亞家族，與擬南芥 AtNHX4~6 同源性高。與其蛋白家族的其他基因相比， AtNHX1 N 末端很保守，對(duì)于 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性非常重要。即使在胞質(zhì)內(nèi) Na+濃度很低的情況下， Na+ 也可主動(dòng)泵進(jìn)液泡中， Cl則被動(dòng)的由陰離子通道進(jìn)入液泡平衡膜內(nèi)外的電荷差別 【 12】 。 三是 NHX1 基因在 NaCl 存在下誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí) NaCl、 KCl、 ABA 正調(diào)控AtNHX1 的轉(zhuǎn)錄水平，在鹽脅迫和 ABA 調(diào)控 AtNHX1 的表達(dá)實(shí)驗(yàn) 【 13】 中， NaCl、KCl、 ABA可以正調(diào)控 AtNHX1 的轉(zhuǎn)錄水平。將 Bvulgaris Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 BvHNHX1 在對(duì)鹽敏感的酵母 nhx1 突變體ena14nhx1 菌株中異源表達(dá)，結(jié)果證實(shí) BVNHX1 至少與酵母 NHX1 基因功能部分等價(jià)。他們認(rèn)為 Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)體促進(jìn) Na+在根細(xì)胞的液泡中積累， 減少了鹽的毒害作用也就增強(qiáng)了植物耐鹽性 【 18】 。 Rajagopal 等 【 9】 認(rèn)為 PgNHX1 功能在整個(gè)生命周期都起作用， Na+大都積累在老葉中，種子中極少。張建秋等研究發(fā)現(xiàn)，他們克隆到的白刺鹽堿脅迫相關(guān)基因片段與目前已知的植物耐鹽基因存在較大差異，這預(yù)示著白刺可能存在較特殊的耐鹽堿機(jī)理 【 28】 。③穩(wěn)定表達(dá)于不同類(lèi)型的細(xì)胞和組織中，而且其表達(dá)量是近似的，無(wú)顯著性差別 。 s1,光照 時(shí)間 14 h PCR 儀 BIORAD C1000Tm Thermal Cycler、 電子天平 sartorius BS223s 、 微波爐 G7020IIYSLV1 、 電泳儀 DYY6D 型 、 渦旋振蕩器 QILIBEIER QL861 VORTEX SHAKER 、 QILIBEIER VORTEX5 型、 LX200 迷你離心機(jī)、 TG16AW 微量高速離心機(jī)、 TGL16M 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、 eppendorf centrifuge 5415 R、高壓滅菌鍋 AUTO clave HVE50、 SANYO MDFU32V 超低溫冰柜、 UVitec 凝膠成像系統(tǒng)、 TH2C1 臺(tái)式冷凍恒溫 振蕩器 。 RNA 的 變性瓊脂糖凝膠電泳 甲醛瓊脂糖凝膠電泳參照《分子克隆手冊(cè)》（第三版）的方法進(jìn)行，膠濃度為 %，檢測(cè)總 RNA 的完整性。 、 采用 AxyGEN 公司的 PCR 產(chǎn)物回收試劑盒回收，方法如下 ： （ 1） 電泳結(jié)束后用潔凈的刀片在長(zhǎng)波紫外燈下切下含有目的 ONA 片段的瓊脂糖凝膠， 裝入 離心管， 計(jì)算凝膠重量，該重量作為一個(gè)凝膠體積 。以同樣的方法再用 700μ lBufferW2 洗滌一次 12021 轉(zhuǎn) 離心 1min。 （ 5） 在超凈工作臺(tái)中向上述管中加入 890μL SOC培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕搖勻，然后固定到搖床上 37℃ 震蕩 60min。 白刺 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 cDNA 3’末端的快速克隆 （ RACE） 我們采用 TaKaRa 公司的 RNA PCRKit （ AMV） 進(jìn)行 3’RACE 反應(yīng) ，擴(kuò)增 cDNA 的 3’末端。 、 回收純化酶切產(chǎn)物 （ 1）將酶切產(chǎn)物加 TEbuffer 稀釋到 250ｕ l，加入 等體積的 酚 氯仿 /異戊醇 （ 25：24： 1） 并 渦旋混 勻，室溫靜置 1min， 12021rpm 離心 2min； （ 2）轉(zhuǎn)移上清， 加入等體積的氯仿 /異戊醇 （ 24： 1） 渦旋混 勻，室溫靜置 1min， 12021rpm 離心 2min； （ 3）轉(zhuǎn)移上清，加入 倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇， 1/10 體積 3M 醋酸鈉（ pH ），輕輕震蕩混勻， 80℃放置 20min； （ 4） 4℃ 12021rpm離心 10min， 棄上清，加 500 μL70%乙醇洗沉淀，吹干后 用 ddH2O溶解。 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計(jì) ) （ 3）將 3’RACE PCR 得到的產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后連接到 pMD18T 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，挑選陽(yáng)性克隆，菌落 PCR 鑒定，送鑒定重組質(zhì)粒菌液 測(cè)序（方法如前所述）。 （ 8） 在涂好的培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記， 37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中 倒置培養(yǎng) 。 、 PCR 膠回收產(chǎn)物與 pMD18T 載體的連接 （ 1） 連接體系如下： pMD18T vector PCR 產(chǎn)物 Solution I 5μL Total 10μL （ 2） 將上述混合液輕輕振蕩后短暫離心， 16℃水浴保溫過(guò)夜 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計(jì) ) 、 pMD18TNHX和 pMD18TAct 轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞 （ 1） 事先將 干式 恒溫 器 的溫度調(diào)到 42℃ ，并取適量的冰塊。 （ 4） 吸取步驟 (3)中的混合液，轉(zhuǎn)移到 DNA 制備管 (置于 2ml(試劑盒內(nèi)提供 )離心管 )中， 室溫下靜置 1min， 12021 轉(zhuǎn) 離心 1min。 如果要使目的片段的 PCR 產(chǎn)量增多，可進(jìn)行二次 PCR 反應(yīng)，即以一次 PCR 產(chǎn)物為模板，再次進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)可驗(yàn)證目的條帶是否為目的基因。在高度保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)一對(duì)兼并引物，由 invitrogen公司合成，序列如下： DegNHXF： 5’ CCICCIATHATHTTYAAYGCIGG 3’ DegNHXR： 5’ –RTAIGCCATIARCATCAT 3’ 肌動(dòng)蛋白的兼并引物則采用已發(fā)表文獻(xiàn)克隆水稻 actin 基因的序列，序列如下： DegAct1： 5’ ATGGTIAARGCIGGITTYGC 3’ DegAct2： 5’ CCACATYTGYTGRAAIGTIS 3’ 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計(jì) ) 圖 為七種 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果（ AtNHX1， ThNHX1， BnNHX1，ZmNHX1， AgNHX1， SSNHX1， MsNHX1分別為擬南芥、鹽芥、油菜、玉米、濱藜、鹽地堿蓬和苜蓿的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列，在 Genbank的登錄號(hào)分別為 ，DQ995339， ， ， ,， ）。（用 的濾膜過(guò)濾除菌，室溫避光保存） （ 6） 50Tris乙酸（ TAE）緩沖液 成分及終濃度 配制 1L 溶液各成分的用量 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計(jì) ) 242g Tris ml 的冰乙酸（ mol/L） 200ml 的 mol/L EDTA（ pH ） 補(bǔ)足 1L （ 7） CTAB 提取 RNA 緩沖液為： 2% (w/v)g/ml CTAB 100 mmol/L TrisHCl (pH ) mol/L NaCl 20 mmol/L EDTA (pH ) % β 巰基乙醇 (使用前加入 ) DEPC 處理水 定容到 500 ml （ 8） TE buffer（ 10mM Tris pH=、 1mM EDTA pH=） . （ 9）酚 /氯仿 /異戊醇 phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCA 25： 24： 1) 25 份水平衡酚， 24 份氯仿， 1 份異戊醇混合，加入 8羥基喹啉 Hydroxyquinoline，使其終溶度為 %. （ 10） 氯仿 /異戊醇 chloroform/isoamyl alcohol (CA 24： 1) （ 11） 水平衡酚 制備 500g 苯酚加入 200ml 滅菌 DEPCH2O ，平衡，直至飽和， 加入 8羥基喹啉 Hydroxyquinoline，終溶度為 %. （ 12） 3M 醋酸銨（ pH ） . （ 13）氨芐青霉素 Ampicillin (100mg/ml )， m過(guò)濾膜過(guò)濾除菌 . （ 14） IPTG (24mg/ml) ， m過(guò)濾膜過(guò)濾除菌 . （ 15） XGal （ 20mg/ml） ， 加入 DMF(二甲基甲酰胺 )溶解，使其終濃度為 80%，20℃避光 保存?，F(xiàn)在還沒(méi)有白刺肌動(dòng)蛋白基因的克