【正文】 修飾的影響。 利用課題組前期工作中建立的篩選與目標(biāo)蛋白相互作用的 ncRNA 的技術(shù)平臺（ RNASELEXseq），從腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中篩選鑒定與腫瘤相關(guān)蛋白相互作用的 ncRNA，研究 ncRNA蛋白質(zhì)間相互作用的分子基礎(chǔ)、動態(tài)時空關(guān)系以及功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò) ； 闡明 ncRNA 在表觀 遺傳修飾和轉(zhuǎn)錄水平上對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，深入探討它們在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的意義；利用生物信息學(xué)和實驗 相結(jié)合的方法鑒定以 ncRNA 為軸心，與之相互作用的蛋白質(zhì)、 RNA 和 DNA，發(fā)現(xiàn) ncRNA 新的作用機制 ，探討在細(xì)胞中是否存在一個通過 RNA蛋白相互作用而構(gòu)成的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)和信息調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 在發(fā)現(xiàn)和鑒定的腫瘤特異性 ncRNA 及其相關(guān)蛋白的基礎(chǔ)上，用腫瘤啟動細(xì)胞模型、腫瘤轉(zhuǎn)移模型（包括腫瘤細(xì)胞 EMT 模型） 以及臨床標(biāo)本， 深入探索具有臨床意義的 ncRNA 及其相關(guān)蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。擬選取目前研究較為充分的 TGF?通路，以及 Wnt 和 NF?B 通路為代表，分別給予乳腺癌細(xì)胞相關(guān)信號分子刺激誘導(dǎo) EMT，隨后進(jìn)行基因表達(dá)譜、通路特異性蛋白質(zhì)譜以及高通量的細(xì)胞內(nèi)磷酸化修飾改變等分析，找到這些通路在 EMT過程中的共同靶點并闡明其在 EMT 中如何扮演關(guān)鍵角色。組蛋白 H3K27 三甲基化酶 EZH2 在乳腺癌中顯著高表達(dá)，并 與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及較差預(yù)后密切相關(guān)，提示其在 EMT 中亦可能扮演關(guān)鍵角色。在惡性腫瘤與干細(xì)胞中分別預(yù)測基因表達(dá)與表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò) ,并進(jìn)一步比較其異同。 利用腫瘤基因表達(dá)和表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，采用計算生物學(xué)方法推測在惡性腫瘤、干細(xì)胞中發(fā)生變化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。從以上兩方面的研究出發(fā)，進(jìn)而對潛在 EMT 關(guān)鍵基因進(jìn)行詳細(xì)的生物學(xué)功能研究?；虮磉_(dá)譜差異分析可同樣應(yīng)用于以 lentivirus 在低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞用shRNA 抑制 Ecadherin 促進(jìn)其 EMT，或高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞引入 Ecadherin 表達(dá)后與原有細(xì)胞的對比研究中。 探討組蛋白修飾如何影響基因的轉(zhuǎn)錄及這種調(diào)控形式如何影響惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。并基于新的ChIPseq 數(shù)據(jù)得到改進(jìn)的貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型。 第 四 年 1） 研究 DNA 甲基化與組蛋白修飾的先后及其相互影響的機制，開展腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)甲基化標(biāo)志物生物學(xué)功能基礎(chǔ)研究； 2） 以過量表達(dá)、 RNA 干擾和染色體免疫沉淀等技術(shù)手段增加或者降低組蛋白修飾候選因子在細(xì)胞內(nèi)的含量，檢測候選因子對組 蛋白修飾復(fù)合物中各成分的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響、對組蛋白修飾酶在靶基因序列上募集的影響和對組蛋白修飾酶活性的影響； 3） 利用細(xì)胞模型和裸鼠動物模型系統(tǒng)研究 ncRNA 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用 ； 4） 繼續(xù)進(jìn)行 EMT 相關(guān)新基因功能分析，并根據(jù)分子生物學(xué)的研究成果，建立必要的動物模型，研究新的 EMT 調(diào)控分子過表達(dá)或基因敲除后對乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響 ； 5） 利用小鼠骨髓嵌合體和乳腺癌動物模型，研究腫瘤相關(guān) 間質(zhì) 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的發(fā)展與轉(zhuǎn)移能力的影響 。 第 三 年 1） 研究影響 DNA甲基化和組蛋白修飾的關(guān)鍵酶，找出連接甲基化與組蛋白的蛋白。 包括 去除反映單個數(shù)據(jù)源自身特征的背景信號，子網(wǎng)絡(luò)的拼接與集成，觀測型實驗數(shù)據(jù)與 (基 因敲1） 找出有代表性的腫瘤抑制基因，分析甲基化譜，篩選出一組腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān) DNA 甲基化標(biāo)志物；掌握腫瘤組織中多種 PcG 蛋白表達(dá)變異規(guī)律； 2） 獲得新的組蛋白修飾組分； 3） 篩選出一批腫瘤相關(guān)的 ncRNA；并確定 ncRNA 及相關(guān)蛋白的表達(dá)譜； 4） 優(yōu)化 EMT 表型誘導(dǎo)條件，完成基因表達(dá)譜及 MeDIPseq，ChIPseq法比較 DNA甲基化及主要組蛋白修飾譜變化實驗 ； 5） 發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)的不同 間質(zhì)細(xì)胞的表型特征，以及一些重要的免疫相關(guān)蛋白、間質(zhì)細(xì)胞中 miRNA及 mRNA的表達(dá)改變； 6） 建立 能夠自動整合并利用多個異質(zhì)實驗數(shù)據(jù) ，適用于大規(guī)模高噪聲的組學(xué)數(shù)據(jù) 的因果推斷方法 ，并開發(fā)為計算軟件 。以組蛋白甲基化修飾作用為例，甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶是 可用于干擾網(wǎng)絡(luò)中的特定節(jié)點。這部分工作涉及去除反映單個數(shù)據(jù)源自身特征的背景信號，子網(wǎng)絡(luò)的拼接與集成，觀測型實驗數(shù)據(jù)與 (基因敲除、 RNA 沉默等 )干預(yù)型實驗數(shù)據(jù)的因果信息集成等多個問題 ；（ 2） 通過開發(fā)根據(jù)數(shù)據(jù)特征自適應(yīng)地調(diào)整網(wǎng)絡(luò)正則化參數(shù)的學(xué)習(xí)算法等方式，以解決如何在具有較 高噪聲和不mRNA及 miRNA表達(dá)譜分析 正常乳腺組織及不同類型的乳腺癌組織 建立基質(zhì)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型 明確基質(zhì)細(xì)胞的基因 /miRNA對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng) TGFβ 信號通路 /REG?蛋白酶體 動物水平 Smad2 亞等位基因表達(dá)小鼠模型 闡明 REG?蛋白酶體與 TGFβ信號通路間的相互作用 細(xì)胞微環(huán)境與腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移 基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用 分子、細(xì)胞水平 基因 /miRNA的功能研究 基因敲除 建立腫瘤與細(xì)胞微環(huán)境網(wǎng)絡(luò)體系 腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞 免疫缺陷 小鼠骨髓嵌合體動物模型構(gòu)建 精確性的系統(tǒng)生物學(xué)實驗數(shù)據(jù)中進(jìn)行可靠因果推斷的實際問題。這些共同通路分子是各信號通路間的交互作用節(jié)點及潛在的 EMT 關(guān)鍵調(diào)控因子，非 編碼 RNA 與腫瘤發(fā)生發(fā)展研究 腫瘤相關(guān) 蛋白結(jié)合的 ncRNA 的研究 闡明 ncRNA蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系 RNASELEXseq 技術(shù)平臺鑒定與腫瘤相關(guān)蛋白結(jié)合的ncRNA Sizefractioned RNA library 鑒定腫瘤啟動細(xì)胞特異 ncRNA 探討 ncRNA蛋白相互作用及對相關(guān)信號通路的調(diào)控 利用體外培養(yǎng)、免疫缺陷小鼠腫瘤移植、腫瘤病理組織檢測等進(jìn)行功能研究 對它們的作用機理進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)胞及分子水平上的分析。采用球囊形成實驗、二維平皿及三維 Matrigel 培養(yǎng) 以及 免疫缺陷鼠體內(nèi)種植和腫瘤組 織等研究體系，系統(tǒng)深入地研究 ncRNA 和蛋白間的相互作用、它們所構(gòu)成的 結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)、 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、以及這些相互作用的生理功能，剖析 ncRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用與意義。表觀遺傳重編程不僅在體細(xì)胞去分化和獲得多能 “干性 ”方面發(fā)揮關(guān)鍵性作用， 也是細(xì)胞癌變過程中獲得無限增殖和侵襲/轉(zhuǎn)移能力的物質(zhì)基礎(chǔ)。 在國際一流雜志（ IF10）發(fā)表論文 8 篇以上，在有影響力的雜志（ IF5）上發(fā)表論文 25 篇以上。本項目的總體目標(biāo)如下：闡明 表觀遺傳關(guān)鍵機制即 DNA 甲基化、 組蛋白修飾 和 非編碼 RNA 對基因表達(dá)調(diào)控的影響 ； 明確表觀遺傳調(diào)控在乳腺癌、肺癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用 ； 揭示 EMT 過程中的表觀遺傳學(xué)變化及 細(xì) 胞重編程機制 ； 闡明細(xì)胞微環(huán)境在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及機制 ； 整合各種信息數(shù)據(jù)，描繪乳腺癌、肺癌 發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 。 六個部分各有側(cè)重，又緊密銜接，團結(jié) 合作，互相促進(jìn)。將以功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法篩選乳腺癌和肺癌中發(fā)生突變或者表達(dá)異常的組蛋白修飾酶以及轉(zhuǎn)錄因子，同時針對 MLL1 等相關(guān)的甲基化酶復(fù)合物組分， LSD1 等去甲基化酶 、 EYA 去磷酸化酶和磷酸化激酶、轉(zhuǎn)錄因子Smad4 和 ER 及其轉(zhuǎn)錄輔助因子等，篩選新的組蛋白修飾基因或 miRNA，利用各種蛋白質(zhì)間相互作用方法驗證篩選獲得的組蛋白修飾復(fù)合物中各成員間的相