【正文】 op2 為中國栽培稻、 pop3為外國栽培稻。 （ 2） 染色 : 將固定液倒出 ， 將凝膠 放入 硝酸銀染液 (10％乙醇 ,%冰醋酸 ,%AgNO3)中 ,輕搖染色 5 min。晾干后長板進(jìn)行硅化處理 (即用親和硅烷處理 ), 短板進(jìn)行反硅化處理 (即用玻璃硅烷處理 ), 處理過程中應(yīng)防止長、短板交叉污染 。 Combined with MseI +CTC LTR of osr172 539。 94℃ /30 s, 56℃ /30 s, 72℃ /60 s, 23 個循環(huán) , 72℃/10 min ） Step 1 94℃ 3min Step 2 94℃ 30sec Step 3 65℃（每個循環(huán)降 ℃） 30sec Step 4 72℃ 1min Step 5 to Step 2 11 cycles Step 6 94℃ 30sec 預(yù)擴增引物 Primers for preamplification EcoRI +0 539。 基因組 DNA 酶切 用限制性內(nèi)切酶 EcoRI 和 MseI (NEB) 進(jìn)行酶切反應(yīng) ,反應(yīng)體系如下 : DNA 300ng 10T4 ligase Buffer EcoRI （ 20 U/μL） MseI （ 20 U/μL） ddH2O Up to 注 :酶切反應(yīng)前 ,先將 DNA、 10T4 ligase Buffer、 ddH2O 混勻 ,4℃放置 30min 后 ,加入內(nèi)切酶 ,混勻、低速離心數(shù)秒 ,37℃溫浴。 （ 4） 室溫下 12,000 rpm 離心 10 min (溫度不低于 15℃ )， 重復(fù)抽提 2 次 。這些遺傳和表觀遺傳學(xué)變異可在一定程度上導(dǎo)致種間雜種及其后代瘋狂分離，并很難在短時間內(nèi)穩(wěn)定和純合，這在一定程度上阻礙了野生優(yōu)異基因在實際育種中的利用 [25]。 Venturi 等運用 SSAP 分子標(biāo)記檢測發(fā)現(xiàn)蘋果新品種的芽變可能是由于逆轉(zhuǎn)座子插入新位點產(chǎn)生。在眾多逆轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記中， SSAP 被認(rèn)為是多態(tài)性最豐富、靈 8 敏度最高、反映的多態(tài)性信息量最多的一種類型。同時許多生物因素，如病毒、細(xì)菌、真菌病原物以及真菌提取物接種，也可以導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄激活 [16,17]。 RT: reverse transcriptase。 LTR 逆轉(zhuǎn)座子根據(jù)其 POL（ Polyprotein）區(qū)編碼蛋白的相似性及排列順序，又可分為 Ty1copia 和 Ty3gypsy 兩類。 幾十年前， McClintock 就曾預(yù)言，漸滲雜交對植物基因組來說是一種強烈的 “ 沖擊 ” (genome shock)，在這種情況下，基因組內(nèi)沉默狀態(tài)的 轉(zhuǎn)座元件 被激活，從而對這一沖擊發(fā)生反應(yīng)并引起基因組的重建。而逆轉(zhuǎn)座子活性的改變對其漸滲系后代群體的多樣性也將產(chǎn)生變化 ,本研究利用SSAP 技術(shù) ,與栽培稻作為參照，對東鄉(xiāng)野生稻漸滲系后代的遺傳多樣性進(jìn)行探究。 關(guān)鍵詞： 漸滲系，栽培稻， SSAP，多樣性 3 SSAP technique analysis of diversity in offspring introgression Chen Zhiqing Directed by Professor Luo Xiangdong Abstract The stable of geic characteristics and high copy number of retrotransposons made it has great potential applications in the field of molecular markers, retrotransposons in higher plants are mainly belongs to the Ty1copia class, The SSAP based on LTRs has bee one of the most useful molecular marker technology. This study use the LTRs of offspring introgression lines derived from Dongxiang wild rice , it is the class of Ty1copia retrotransposon which was separated in our laboratory, established the study of SSAP technology of the diversity of Dongxiang wild rice introgression materials including introgression lines (ILs) derived from Dongxiang Wild Rice and cultivated rice from China and Foreign were used to investigate the geic diversity by using SSAP technology. The SSAP primers were designed according to the LTR region of Ty1copia like retrotransposon (houba, osr15 and osr17). The result showed that a total of 140 sepecific bands were amplified. Six families were distinguished after cluster and alignment analyses of the bands. ILs derived from Dongxiang Wild Rice exsit in all of the families. The average Nei39。 本研究利用本實驗室分離到的 東鄉(xiāng)野生稻漸滲系后代 Ty1copia 類逆轉(zhuǎn)座子的LTRs,建立了研究 東鄉(xiāng)野生稻漸滲系后代 多樣性的 SSAP 技術(shù)。漸滲系后代的 平均 Nei39。這種方法已經(jīng)應(yīng)用于各種植物的遺傳圖譜構(gòu)建、基因多態(tài)性分析、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建、植物進(jìn)化研究以及由逆轉(zhuǎn)座子導(dǎo)致的基因功能改變分析 [2]。本研究利用東鄉(xiāng)野生稻和栽培稻協(xié)青早 B 構(gòu)建漸滲系進(jìn)行了漸滲系后代遺傳多樣性研究 [6]。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)座機制不同，轉(zhuǎn)座元件可分為兩個主要類型：第一類以 RNA 為中間媒介通過 6 DNARNADNA 的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座，每轉(zhuǎn)座一次其拷貝數(shù)就增加一個，由于其轉(zhuǎn)座過程經(jīng)歷逆轉(zhuǎn)錄過程，因此稱為逆轉(zhuǎn)座子；第二類是以 DNADNA 方式增殖的轉(zhuǎn)座元件，它們從基因組的一個位點切下后插入基因組的另一個位點，轉(zhuǎn)座前后不涉及拷貝數(shù)的變化，稱為 DNA 轉(zhuǎn)座子 [11]。 圖 1 LTR 逆轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu) LTR：長末端重復(fù)； gag：種群專一性抗原； pro：蛋白酶； RT：逆轉(zhuǎn)錄酶； RnaseH：核糖核酸酶； int：整合酶； PBS：引物結(jié)合位點； PPT：多嘌呤位點 The structures LTR retrotransposons 7 LTR: long terminal repeat。（ 2）植物基因組中存在抑制逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座活性的重要調(diào)節(jié)機制。 LTR 逆轉(zhuǎn)座子中的 RNaseH 專一地消化 RNADNA 雜合鏈上的 RNA，形成單鏈 DNA，然后以此單鏈 DNA 為模板，位于 3’端 LTR 上游的多嘌呤序列（ PPT）作為引物合成雙鏈線性 DNA 鏈。因此，理論上 SSAP 多態(tài)性高于 AFLP，目前許多有關(guān) SSAP 和 AFLP 相比較的報道也表明前者多態(tài)性高于后者 [19,20,21,22]。然而，目前利用東鄉(xiāng)野生稻成功改良栽培稻數(shù)量性狀的報道仍很少 。 表 1 實驗材料 Table 1 Materials used in the experiment 品種 Cultivars 名稱 name 漸滲系 后代 IL533 IL524 IL1 IL5 IL11 IL12 IL14 IL18 IL15 IL1IL IL22 IL533 IL IL1 IL3 IL8 IL75 中國水稻 空育 13 哈 0 密陽 4 金 23B、 珍汕 97B、 南京 6號 、 臺農(nóng) 1號 、 測 6 桂 9 谷梅 4號 、 日本晴 、 TP30 稻花香 、 XB 國外水稻 K12 、 trenasse 、 wells 、 Bengal 、 Lemont 、 R15 、 242 cocodrie、Ronolo、 Katy、 della、 tempheton、 francis、 dellrose 實驗方法 模板 DNA 的制備 所有材料在長至三葉一心時期取幼嫩的葉片 ,采用改良的 CTAB 法提取水稻基因組 DNA[26], 具體步驟如下 : （ 1） 取 3~5 g 水稻幼嫩的葉片剪碎放入研缽中 ,加液氮充分研磨至粉碎 ,適量分裝至 2 mL 離心管中 ,裝 1/3 左右 。 （ 8） 然后于離心管中加入 600 μL 氯仿 :異戊醇 (24:1), 輕輕上下顛倒混勻 10 min 后 12,000 rpm 離心 10 min,吸取上清液到 mL 的離心管中先后加入 1/10 體積的 3M 醋酸鈉 (pH=)和兩倍體積預(yù)冷的無水乙醇 ,置 20℃ 冰柜中 。預(yù)擴增產(chǎn)物用 1%的瓊脂糖凝膠 進(jìn)行檢測 ,根據(jù) 彌散帶 亮度確定其濃度 ,用 ddH2O 稀釋適當(dāng)倍數(shù)后 (約 15 倍 )用于選擇性擴增模板。GGTGTCTTTCTATTATCCCTTAT339。 擴增產(chǎn)物的檢測 變性聚丙烯酞胺膠電泳 選擇性 擴增產(chǎn)物 在 6%的變性聚丙烯酰胺凝膠 (PAGE 膠 ,含 6% 丙烯酰胺 , %N,N39。 （ 4） 電泳 :上下層電泳緩沖液都為 1TBE,電泳之前清洗點樣孔 3 遍。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 沒有條帶擴增出來記為 “ 0”， 擴增出目的條帶的記為 “ 1” 。說明中國和外國的栽培稻遺傳多樣性非常接近，而東鄉(xiāng)野生稻漸滲系后代的遺傳多樣性則要高于栽培稻。 He, Nei39。而東鄉(xiāng)野生稻漸滲系幾乎在 6 類中都具有分布，表明漸滲系群體是研究水稻馴化的很好的材 料。說明其 LTR 逆轉(zhuǎn)座子插入位點及其附近序列變異最大。再次致上我無限的謝意和感激！ 。 盡管漸滲雜交是利用野生有利基因的有效途徑 , 但在漸滲過程中會導(dǎo)致許多遺 18 傳和表觀遺傳上的改變，如染色體結(jié)構(gòu)的變異、序列的丟失和出現(xiàn)、 LTR 逆轉(zhuǎn)座子活性的改變。正如圖所示 , 栽培稻的親緣關(guān)系較近，東鄉(xiāng)野生稻漸滲系分布于每一個家族中。 Note: Na, number of alleles。從表中可以看出， pop pop2 以及 pop3 的 平均 Nei39。 （ 4） 終止 : 將顯影液倒出 ,凝膠重新放入固定液中 ,固定 5 min。灌膠后用夾子夾緊 ,放置 4 h 以上或者過夜 。GCGTGTTTCGTGCCTTCG339。 GATGAGTCCTGAGTAA 339。