【正文】 外 控標(biāo)準(zhǔn) 本試劑不提供對照標(biāo)準(zhǔn)品。但是 20%試條顯色條帶的不整體，略有擴散和變深； 80%的顯色條帶略有變淺； 40%、 60%反應(yīng)體系很正常，顯色條帶清晰、集中。 強陽性標(biāo)本可以在 2 分鐘顯色，弱陽性樣本會在 10～30分鐘顯色， 為了判斷 結(jié)果的準(zhǔn)確和一致，結(jié)果判定以 30分鐘內(nèi)為準(zhǔn)。 檢測前應(yīng)將 樣 本恢復(fù)至室溫，冷凍的 樣 本應(yīng)等完全融化后方可使用。 縱上所述，該試劑對檢測樣本的要求有： 樣本采集前對受檢者無特殊要求，不需禁食， 按照常規(guī)的實驗室程序收集血清 /血漿 樣 本。 5ul/滴 03 硅膠干燥劑 1袋 /袋 04 鋁箔袋 1 個 2檢測條組成及結(jié)構(gòu) 檢測條由樣品墊、膠體金膜、包被膜、吸收墊 、塑料板等組成。 包被 (1)抗 HBs 包被抗體 (檢測線 )、 羊抗鼠多克隆抗體 (對照線 )使用 B101 分 別稀釋至、 ，分別加入噴點包被機的 1號杯、 2號杯； (2)調(diào)試自動噴膜機，噴液量設(shè)定為 ，導(dǎo)軌速度 。 膠體金 抗體結(jié)合物制備 每 4000ml膠體金溶液，首先加入 A104 32ml，混勻，將上述膠體金溶液按照 15181。 － － － － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 3ng/ml ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 從上述結(jié)果可以看出，當(dāng)濕度低于 45%時，室溫 6 小時 ，檢測 2ng/ml 參考品時，因為硝酸纖維素膜沒有徹底干燥，樣品的爬升速度較慢，而且膜面褪白不是很好； 室溫12 時、 37℃ 干燥 4 小時 時，檢測結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，樣本爬升的速度正常，膜面干凈，結(jié)構(gòu)直觀、容易判斷；室溫 18小時、 37℃ 干燥 16小時 的檢測結(jié)果一致，色度沒有明顯的差別。 封閉時間的選擇 設(shè)定不同的封閉條件：室溫 (1小時、 2小時、 4 時、 6小時 )、 37℃ (1小時、 2小時、4 小時、 6 時 )，封閉后再次經(jīng) 37℃干燥 4 小時后，與制備好的樣品墊、免疫金結(jié)合墊以及其它輔料依次粘貼制成試劑條，檢測內(nèi)質(zhì)控靈敏度參考品，在 30 分鐘內(nèi)判定結(jié)果。 我們通過對 室溫、 37℃的產(chǎn)生的結(jié)果對比，即當(dāng) 室溫 5 小時時， 37℃干燥 2h 時，無紡布干燥不徹底，膠體金 抗體爬升速度較慢，增加了結(jié)果判定時間，同時會出現(xiàn)假 第 13 頁 共 23 頁 陽性。 對照線 包被濃度的確定 第 12 頁 共 23 頁 確定包被體積后 ()，將稀釋成不同 羊抗鼠 IgG 抗體 濃度： 2mg/ml、 1mg/ml、 ， 進行硝酸纖維素膜噴涂，重復(fù)做三批。 3）建議減小裁切寬度以降 低靈敏度，消除假陽。 第 11 頁 共 23 頁 表 6 鼠抗 HBsAg抗體 GOLD工作液稀釋倍數(shù)確定 稀釋倍數(shù) 檢測樣本 1/30 1/35 1/40 1ng/ml － － 177。 177。 第 10 頁 共 23 頁 檢測線包被濃度的確定 當(dāng) 噴膜量為 ， 將 抗 HBs 單克隆抗體 A 稀釋成不同濃度： 3mg/ml、 、 2mg/ml、 、 1mg/ml， 分別和 1mg/ml 的羊抗鼠 IgG 抗體同步噴涂硝酸纖維素膜。g的比例加入鼠抗 HBs 單克隆抗體 B，共 ，混勻；靜置 5min； 3)分別按照 %的比例加入膠體金穩(wěn)定劑 毫升，混勻，靜置 5分鐘； 4)5000、 7000、 9000rpm 離心 30min，分別收集沉淀，合并三次收集的沉淀。l、 、3181。l 10181。l、 16181。 表 1 膠體金一覽表 A102（ ml） A101（ ml） 顏色 最大吸收波長 (nm) 2 2 酒紅 524 鼠抗 HBs單克隆抗體 B與膠體金結(jié)合 pH 范圍確定 1) 取 9 個 1ml 離心管，每管加入 1ml 2:2 的膠體金溶液； 2) 每管分別加入 pH調(diào)節(jié)劑 0181。 2實驗儀器 : 自動噴膜機 美國 BIODOT 公司 XYZ3050 封口機 溫州兄弟 SF150 切條機 Kinematic Matrix2360 第 7 頁 共 23 頁 高速冷凍離心機 BECKMAN J2MC 紫外分光光度儀 Helios Gramma 電子分析天平 Sartorius BS210S 生物安全柜 上海瑞仰 BSCⅡ B1101 壓力滅菌器 上海博迅 YXQLS18SI 微量加樣槍、刻度吸管 、酶標(biāo)板 、純水機等 。 檢驗 方法 檢測試劑、待檢樣品和其它檢測用材料等測試前需平衡至室溫 ： 1) 打開鋁箔袋，取出 檢測試劑。 2) 樣 本收集后應(yīng)盡快分離血清 /血漿以避免融血。 包被 (1) 抗 HBs 單克隆 抗體 A(檢測線 )、 羊抗鼠 lgG 多克隆抗體 (對照線 )使用 B101 分 別稀釋至 、 ，分別加入噴點包被機的 1號杯、 2號杯； (2) 調(diào)試自動噴膜機，噴液量設(shè)定為 ，導(dǎo)軌速度 。 膠體金 抗體 結(jié)合物制備 ： 標(biāo)記原料：鼠抗 HBs 單克隆抗體 B (Y002/ HBsAg) 每 4000ml 膠 體金溶液，首先加入 32ml A104，混勻，將上述膠體金溶液按照 15181。 通過 對樣本用量、試劑用量、反應(yīng)溫度、質(zhì)控方法等研究，建立制造工藝和質(zhì)控方法，確定本檢測試紙的操作步驟、結(jié)果判定以及注意事項等，最終建立生產(chǎn)工藝和反應(yīng)體系。 無論 HBsAg 是否存在于測試樣本中 ， 一條有色條帶都會出現(xiàn)在對照線 區(qū) 內(nèi) 。待溶液冷卻至室溫后，加入純化水補充至 4000ml。 1 mm)，記做生產(chǎn)中間體條組分 S4。記做生產(chǎn)中間體條組分 S1。如果收集的當(dāng)天不使用，應(yīng)當(dāng)冷藏 28℃ 保存，超過 7天應(yīng)當(dāng)冷凍于 20 ℃ 保存。 表明 測試樣本中 未檢出 乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)； 3) 無效結(jié)果 ： 當(dāng)對照線 區(qū)內(nèi) 未出現(xiàn) 有色條 帶 ， 表明試驗失敗或試劑失效 ， 需進行重復(fù)檢測。儲存?zhèn)溆谩、 10181。l 4181。 最小蛋白濃度的確定 1) 取一 48孔酶標(biāo)板，每孔分別加入含 %pH 調(diào)節(jié)劑的 2： 2膠體金 100181。g/ml） ) HBsAb濃度 項 目 5 10 15 20 25 膠體金 2:2 pH調(diào)節(jié)劑 % 顯 色 紫黑 紫黑 紫紅 紫紅 酒紅 酒紅 酒紅 酒紅 酒紅 根據(jù)上述檢測結(jié)果，當(dāng)標(biāo)記抗體的量不足，則不能穩(wěn)定膠體金溶液，所以根據(jù)膠體金顏色變化，我們選蛋白濃度 15181。g/ml 的抗體濃度進行標(biāo)記結(jié)果符合要求。 － 2ng/ml 177。而 3mg/ml、 、 2mg/ml ，檢測 1ng/ml 與 2ng/ml均出現(xiàn)假陽，結(jié)合成本考慮，選擇 ； 2) ，故建議提高膠體金工作液的稀釋倍數(shù)以降低靈敏度。 ＋ ＋ 備注： 100A524nm,V1/ 100A524nm,V1/3 100A524nm,V1/40分別用 1/ 1/3 1/40代替。 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 3ng/ml 177。 表 9 鼠抗 HBsAg抗體 GOLD結(jié)合物反應(yīng)膜干燥比較 條件及時間 檢測樣本 37℃ 室溫 2（ h） 4（ h） 6（ h） 5（ h） 10（ h） 15（ h） 1ng/ml － － － － － － 2ng/ml 177。 － － － 177。 封閉干燥時間選擇 設(shè)定不 同的干燥條件：室溫 (6小時、 12小時、 16小時、 18 小時 )、 37℃ (4 小時、8小時、 12小時、 16小時 )，濕度均低于 45%。待溶液冷卻至室溫后，加入純化水補充至 4000ml。 1 mm)，記做生產(chǎn)中間體條組分 S4。記做生產(chǎn)中間體條組分 S1。結(jié)果如下， 表 18 溶血、黃疸及 血脂 的樣品對本試劑的檢測結(jié)果的干擾 不同干擾物 檢測樣本 對照 血紅素 甘油三酯 N1 － － － － P4 ＋ ＋ ＋ ＋ HBsAg1ng/ml － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ HBsAg4ng/ml ＋ ＋ ＋