【正文】 對于 Fi=Fo=F， V恒定的體系 ， 總細(xì)胞濃度為： NNDdtdNaps ?? ???D替換為 αsD，可得到 μap、 μ、 kd 6． 細(xì)胞裂解期 低稀釋速率的連續(xù)培養(yǎng) （ 無論細(xì)胞是否截留 ） 和分批培養(yǎng)的靜止后期和衰亡期 ， 細(xì)胞活性較低 ， 細(xì)胞裂解相當(dāng)重要 。表觀比生長速率： DdtNdap ??)ln(?D為稀釋速率（ Fo/V） 細(xì)胞活性降低時(shí)， μ遠(yuǎn)離 μap（ D恒定）。 oiFFdtdV?? 假定總細(xì)胞處于平衡狀態(tài)： 總細(xì)胞的積累速率 =細(xì)胞的流加速率－細(xì)胞的流出速率＋細(xì)胞生長速率－細(xì)胞裂解速率。 M期一般時(shí)間很短 ， 為 ～ 1小時(shí) 。 纖維素親水性強(qiáng) ， 對滲透性影響較大 ， 不適合于 Vero細(xì)胞及其他貼壁細(xì)胞培養(yǎng) 。 纖維管的空腔組成的內(nèi)室：灌流含氧氣的培養(yǎng)基 纖維管之間的空間組成的外室：細(xì)胞生長 。 上部微載體依靠沉降作用與培養(yǎng)基分離 ，一部分培養(yǎng)基被收集 ， 提取產(chǎn)物 ， 同時(shí)排出部分廢物；其余部分再流加等體積新培養(yǎng)基 ， 提供營養(yǎng) ， 實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng) 。 適用于懸浮細(xì)胞分批培養(yǎng) ， 微載體和連續(xù)培養(yǎng) 。 現(xiàn)在主要用于生產(chǎn)疫苗如流行性腮腺炎 、風(fēng)診麻疹等或用作種子罐 。 流化床包埋培養(yǎng)人鼠雜交瘤細(xì)胞 ， 整個(gè)反應(yīng)器有效濃度達(dá)4 108/ml， 單位體積產(chǎn)量提高 200～ 300倍 。 在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中 ， 比生長速率比稀釋速率大 。 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng) ， 細(xì)胞密度可達(dá) 107， 生產(chǎn)抗體的產(chǎn)量比分批操作提高幾～ 10倍 ， 可達(dá) 500 mg/L。 培養(yǎng)結(jié)束后 ， 收獲微囊 ， 破微囊 ， 純化抗體 ， 純化工藝簡單 ， 應(yīng)用前景廣 。 共價(jià)交聯(lián)：雙功能試劑處理細(xì)胞 ， 使細(xì)胞之間交聯(lián)的固定化方法 。 在懸浮培養(yǎng)中要注意發(fā)揮 動(dòng)物細(xì)胞的特性 。 主要用于攪拌反應(yīng)器、固定床和流化床反應(yīng)器。 纖維素微載體 DE52和 DE53： 適合多種細(xì)胞培養(yǎng) 。 微載體培養(yǎng)兼具貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點(diǎn) ， 有很大的比表面積 ， 供單層細(xì)胞貼附和增殖 。一般數(shù)天就長滿整個(gè)表面 ， 形成致密的單層細(xì)胞 。 緩慢冷凍 ， 細(xì)胞放入 CO2低溫冰柜或液氮中 ， 溫度為 150— 190℃ ， 細(xì)胞的全部活動(dòng)幾乎處于停止?fàn)顟B(tài) 。 掌握好最佳時(shí)期：剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞 ， 過早產(chǎn)量低 ，過晚健康狀態(tài)不佳 。 有些細(xì)胞對支持物的依賴性不嚴(yán)格 ， 可貼壁生長 ， 可懸浮生長 。 無限細(xì)胞系：當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過自然或人為的因素轉(zhuǎn)化為異倍體后 ， 才能變?yōu)闊o限細(xì)胞系 。 原代培養(yǎng)： 從體內(nèi)取出的組織細(xì)胞進(jìn)行體外接種培養(yǎng) ， 原代培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞 ， 它生長分裂并不旺盛 ， 與體內(nèi)細(xì)胞相似 ，適合于藥物檢測實(shí)驗(yàn) 。 ：細(xì)胞死亡數(shù)目大于分裂數(shù)目的時(shí)期 。 單個(gè)細(xì)胞周期包括細(xì)胞間期 、 細(xì)胞分裂期 ，間期又包括間期 DNA合成期和間期 2三個(gè)時(shí)期 。 一旦出現(xiàn)沉淀 ， 要重新配制 。 BSS配制： 1） 先分別溶解 CaCl MgCl MgSO4。 Tris所含氨基具有高的化學(xué)反應(yīng)活性 ， 能抑制細(xì)胞生長 ， 并通過生物膜 ， 它調(diào)節(jié) pH要依賴于溫度的變化 ， 因此不宜作為培養(yǎng)液 。 2. 緩沖液 緩沖液：弱酸與弱酸鹽或弱堿與弱堿鹽組成的 ， pH恒定但不干擾試驗(yàn) 。 在含有營養(yǎng)和貼壁因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 ， 加入適宜的細(xì)胞生長因子 ， 細(xì)胞良好生長 ， 適合于制藥生產(chǎn) 。 常添加抗生素 ，以避免輕度污染 。胎牛血清 、 新生?；虺膳Ｑ?、 馬血清 、 雞血清 、 羊血清及人血清 ， 最廣泛應(yīng)用的為胎牛血清和新生牛血清 。在大規(guī)模生產(chǎn)中 ， 除了青霉素和 β內(nèi)酰胺類抗生素外 ，其它抗生素可以使用 。 5. 生長基質(zhì) 改變生長表面特性 ， 促進(jìn)細(xì)胞貼附的物質(zhì) 。 4. pH值 動(dòng)物細(xì)胞對 pH值很敏感 ， 低于 響 。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度為 37℃ ， 雞細(xì)胞為 39－ 40℃ ，而昆蟲類細(xì)胞為 25－ 28℃ 。 為了細(xì)胞的貼壁生長 ， 必需添加貼附因子 ， 纖維結(jié)合蛋白 、膠原等 ， 伸展因子如表皮生長因子 、 成纖維細(xì)胞因子等 。 磷是核酸 、 磷脂等的組成成分 。 維生素 D為視固醇類化合物 ， 主要是調(diào)節(jié)鈣磷代謝 。 離體容易失去 ， 20種氨基酸中至少 12種是必需氨基酸： 精氨酸 、 半胱氨酸 、 組氨酸 、 異亮氨酸 、 亮氨酸 、 賴氨酸 、蛋氨酸 、 苯丙氨酸 、 蘇氨酸 、 色氨酸 、 酪氨酸 、 纈氨酸等 。 動(dòng)物細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境的要求高 ， 不同細(xì)胞系的要求也不盡相同 ， 培養(yǎng)基要盡可能與體內(nèi)生活條件接近 。 影響因素：細(xì)胞培養(yǎng)物的密度、 DNA的大小、純度與用量、化學(xué)試劑的用量與處理時(shí)間、促進(jìn)劑的使用等。 分泌表達(dá)重組蛋白的能力比 Sf9細(xì)胞系高 20多倍 ， 能適應(yīng)懸浮培養(yǎng) 。也可作為轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，用于表達(dá)外源基因的蛋白質(zhì)藥物和病毒的檢測。 3T3： HIN Swiss小鼠胚胎培養(yǎng)物中分離建立的連續(xù)細(xì)胞系，能大量表達(dá)外源蛋白，廣泛用于藥物毒理學(xué)研究。 有多種衍生突變株應(yīng)用于藥物的生產(chǎn) ， 培養(yǎng)時(shí)需要添加脯氨酸 。 英國 Welle公司用 Namalwa細(xì)胞的反應(yīng)器達(dá) 8000L， 用Sendai病毒誘導(dǎo) ， 大規(guī)模生產(chǎn) α干擾素 ， 并批準(zhǔn)上市 。 亞細(xì)胞定位信號(hào)肽：目標(biāo)基因產(chǎn)物將轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核 、 線粒體 、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞質(zhì)中 ， 這對基因的功能研究非常合適 。將 dhfr與目標(biāo)基因串連， dhfr的 cDNA插入內(nèi)含子中，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被剪切，翻譯不出蛋白質(zhì)，而目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物得到翻譯。 動(dòng)物基因的啟動(dòng)子：轉(zhuǎn)錄因子 EF1α啟動(dòng)子 、 泛素蛋白啟動(dòng)子 、 β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子 、 干擾素 α啟動(dòng)子 、 IgG啟動(dòng)子 、鼠金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子等 。 大腸桿菌的復(fù)制子，細(xì)菌中繁殖。 研究開發(fā)的主要方向：有效的病毒表達(dá)載體； 決定基因表達(dá)時(shí)期啟動(dòng)子 ， 無血清培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞系 。 表達(dá)產(chǎn)物在昆蟲細(xì)胞內(nèi)能結(jié)晶 ， 對產(chǎn)物純化非常有意義 。昆蟲病毒主要有桿狀病毒科核多角體病毒 。 表達(dá)系統(tǒng) O糖基化 寡聚甘露糖 高甘露糖 復(fù)合體 大腸桿菌 0 0 0 0 釀酒酵母 ＋＋ 0 ＋＋＋＋ － 昆蟲 Sf9 ＋＋ ＋＋＋＋ 0 － 倉鼠 CHO ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ 倉鼠 BHK ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ 鼠雜交瘤 ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ 鼠骨髓瘤 ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ C127 ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ J558L ＋＋ － 0 ＋＋ 人淋巴細(xì)胞 ＋＋ 0 0 ＋ Namalwa ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋ 人鼠雜交瘤 － ＋＋ 0 ＋＋ 大腸桿菌 酵母 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 產(chǎn)物濃度 高 高 低 分子量 低 高 高 二硫鍵 有限 不受限制 不受限制 分泌 無 有或無 有 形式 包涵體 單鏈 ， 天然 單鏈 ， 天然 折疊 不正確 正確 正確 糖基化 無 可能 完全 逆轉(zhuǎn)錄病毒 無 無 可能 熱原 可能 無 無 培養(yǎng)特點(diǎn) 容易 容易 較難 ， 成本高 分離純化 復(fù)雜 復(fù)雜 簡單 細(xì)胞類型 表 達(dá) 水 平（ μg/ml） 猴 CV1 1～ 10 猴 CV1 猴 COS 1 小鼠成纖維細(xì)胞 C127 1～ 5 小鼠成纖維細(xì)胞 3T3 ～ CHO（ dhfr－ ） ~ CHO（ dhfr－ ） 10 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的不足是細(xì)胞生長緩慢 ， 生產(chǎn)效率較低 ，產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他表達(dá)系統(tǒng) 。 要根據(jù)糖基化的結(jié)構(gòu)，選擇適宜的細(xì)胞系。 在細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白時(shí) ， 磷脂酶 C可切割此類蛋白 ，有利于純化 。 復(fù)合型含有 2個(gè)以上支鏈 ， 如乙酰半乳糖胺 、 果糖和唾液酸等 。 而蛋白質(zhì)的糖基化無需模板指導(dǎo) ， 因此糖蛋白的寡糖結(jié)構(gòu)容易發(fā)生變化 。谷氨酰胺與丙酮酸和草酰乙酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用，生成丙氨酸和天門冬氨酸，丙氨酸可進(jìn)入培養(yǎng)液并積累。 丙酮酸還可轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶 A，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，徹底氧化產(chǎn)生 CO2和水。 一 、 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與特征 1. 動(dòng)物細(xì)胞的特征 細(xì)胞膜 、 細(xì)胞質(zhì) 和細(xì)胞核 沒有細(xì)胞壁 。基因工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝 藥用蛋白質(zhì)的合成復(fù)雜 ， 要有精確折疊的空間結(jié)構(gòu) ，要有糖基化 ， 才能使藥物發(fā)揮真正的功能 。 亞細(xì)胞器 ， 功能獨(dú)特 。小部分（ 4％～ 8％）葡萄糖進(jìn)入戊糖磷酸途徑，把葡萄糖轉(zhuǎn)化為 7碳糖和還原力NADPH， 5碳糖用于核酸合成，其他中間產(chǎn)物進(jìn)入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝。在快速生長的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)體系，轉(zhuǎn)氨作用是主要的代謝途徑。 糖蛋白的單糖單元 :αD葡萄糖 、 αD半乳糖 、 αD甘露糖 、 αD木糖 、 αD巖藻糖 、 N乙酰 αD葡萄糖胺 、 N乙酰 αD半乳糖胺和 αN乙酰神經(jīng)氨酸 （ 或唾液酸 ） 。 雜合型至少含有一條復(fù)合糖鏈 ， 另一個(gè)鏈含有甘露糖 。 細(xì)胞特異性糖基化途徑 —— 淋巴細(xì)胞中進(jìn)行 ， 它不依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體 。 細(xì)胞系 Fuc Gal 唾液酸 α1,6 α 1 , 3 Fuc α1 , 3Gal SO4 GalNAc α 2 ,3 α2,6 糖基化 等分GluNAc BHK ++ 0 + 0 ++ 0 0 CHO ++ 0 0 ++ 0 + 0 鼠雜交瘤 ++ 0 ++ 0 ++ 0 +++ 0 C127 ++ 0 ++ ++ ++ ++ +++ 0 J558L ++ 0 ++ ++ ++ +++ 0 人淋巴細(xì)胞 ++ 0 0 0 + + 0 ++ 人垂體 ++ 0 0 +++ + + 0 ++ Namalwa ++ 0 0 0 ++ ++ 人鼠雜交瘤 ++ 0 0 0 + + + 0 2. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 基因工程哺乳動(dòng)物細(xì)胞系：失去分化能力的無限生長細(xì)胞系 ， 即永久性細(xì)胞 。 骨髓細(xì)胞 MPG－ 11生產(chǎn) IgG的能力為 5pg/(細(xì)胞 .分鐘 )，10L反應(yīng)器 ， 密度為 107/ml， 生產(chǎn)能力不到 1g/d。 苜蓿尺蠖核多角體病毒－秋黏蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) ， 家蠶核多角體病毒－家蠶幼蟲表達(dá)系統(tǒng) 。 4） 高效表達(dá)：可容納較大的外源基因 （ 12kb） ， 表達(dá)數(shù)個(gè)外源基因 ， 并且正確裝配成有功能的分子 。 第二節(jié) 基因工程動(dòng)物細(xì)胞系的構(gòu)建 構(gòu)建高效表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞 篩選鑒定 獲得生產(chǎn)用工程化細(xì)胞系 動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體：病毒載體，質(zhì)粒載體。 抗生素抗性標(biāo)記，原核細(xì)胞篩選。 噬菌體 T7啟動(dòng)子比動(dòng)物基因啟動(dòng)子表達(dá)水平高 。 順反子在多亞基蛋白的偶聯(lián)表達(dá)及其控制策略等方面有廣泛應(yīng)用前景。 基因的擴(kuò)增系統(tǒng)： 在逐漸提高選擇壓的情況