第六章基因的轉移技術-免費閱讀
【正文】 3 3 39。C39。A39。C39。539。 3 39。大多數(shù)的 λ蛋白質(zhì)合成可用宿主已有的溶源化 λ或攜帶的質(zhì)粒（含有 CI基因）抑制。 由于該系統(tǒng)存在著核酸酶和蛋白酶，因此不能用于翻譯很大的 mRNA ，該系統(tǒng)僅為前一系統(tǒng)活性的 1/10。 一．基因導入方法 1．細胞融合 106 2．微細胞介導的基因轉移 小于或等于 106 3．染色體介導的基因轉移 106利用中期染色體DNA進行轉移 4．脂質(zhì)體介導的基因轉移 約 2 104先用脂質(zhì)體包裝 DNA，然后與 細菌，植物原生質(zhì)體融合 5． 磷酸鈣沉淀介導基因轉移 103— 107 6．原生質(zhì)體融合術 約 — %溶菌酶處理細菌，再與動物細胞，植物原生質(zhì)體融合 7．顯微注射法 約 1— 10%直接注射入細胞質(zhì)或細胞核內(nèi) 顯微注射法 — 利用顯微操縱器，將 DNA直接注射到細胞核中 穿刺法 — 利用注射顯微鏡將微注射針固定，然后穿刺將 DNA注入細胞核內(nèi) 顯微注射穿刺法 8． 電脈沖介導的基因轉移 104利用電脈沖改變生物膜透性， DNA可直接進入各種細胞 9． 重組 RNA病毒感染 約 10— 100%適用于動植物細胞 10． 重組 DNA病毒感染 約 100%適用于各種細胞 11． 直接轉化法 包括： 完整細胞或原生質(zhì)體 與 DNA直接接觸， DNA進入細胞內(nèi)，這種方法適用于細菌，酵母菌，真菌和植物細胞。 一．轉錄系統(tǒng) 1. 體外轉錄系統(tǒng) 1）分離 RNA聚合酶，然后在體外進行待測 DNA的轉錄反應 2）利用全細胞抽提液，加入外源 DNA，目前使用最廣泛的抽提液來自海拉細胞和 KB細胞 3）利用具有 SP6, T3和 T7啟動子的載體轉錄插入的外源 DNA 2. 體內(nèi)轉錄系統(tǒng) 先分離細胞核，再進行轉錄反應 二．翻譯系統(tǒng) 體外翻譯系統(tǒng) （ In vitro translation system）又稱之為體外蛋白質(zhì)合成系統(tǒng) (in vitro protein synthesis system)，是一種細胞裂解物，這種系統(tǒng)只有翻譯功能，當加入外源 mRNA，能量物質(zhì)和氨基酸，該系統(tǒng)就能合成蛋白質(zhì)，經(jīng) SDS— PAGE后可檢測出翻譯活性。 因該系統(tǒng)無內(nèi)源核酸酶和蛋白酶，可用于大分子 mRNA 的翻譯。 2. 真核生物系統(tǒng) 1) 哺乳動物細胞 2) 兩棲動物卵母細胞 第二節(jié) 外源基因的表達 一 . 當外源基因引入某宿主細胞表達時，應考慮以下各種因素： 1. 外源基因的啟動子順序能否在宿主細胞起作用（利用表達載體） 2. 對轉錄產(chǎn)物能否進行加工修飾（利用 cDNA） 3. 轉錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性 4. 轉錄產(chǎn)物的核糖體識別順序能否為宿主細胞的翻譯系統(tǒng)所識別（利用表達載體的基因融合技術） 5. 密碼子的使用頻率（選用適當宿主細胞） 6. 翻譯產(chǎn)物的后修飾 選用適當宿主細胞 7. 翻譯產(chǎn)物的穩(wěn)定性 8. 外源基因產(chǎn)物對宿主是否有害 9. 外源基因產(chǎn)物產(chǎn)量（選用不同
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