動物寄生蟲病pcr診斷技術(shù)doc-免費閱讀
【正文】 5．PCR產(chǎn)物直接純化時，擴增產(chǎn)物的特異性必須非常高，對于特異性差的反應(yīng)，應(yīng)從瓊脂糖凝膠中回收目的片段，引物的長度如大于60 bp，同樣要求用膠回收法來回收擴增的DNA片段。6．凝膠中含有EB（有潛在的致癌性），不要直接用手接觸凝膠，操作時要戴上手套。如同時進(jìn)行多個蟲體DNA的提取時一定要作好標(biāo)記。2．反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行。l PCR純化產(chǎn)物加適量加樣緩沖液混合，電泳檢查回收率，可根據(jù)帶的亮度估算DNA回收純化后的濃度。③ 倒掉收集管中的廢液，將UNIQ10柱放入同一收集管中，加入500 181。l Elution Buffer或雙蒸水（pH＞）到UNIQ10柱中，室溫或37℃放置2 min。l Binding buffer的量來計算，加入相應(yīng)體積的Binding buffer，混勻后置于50~60℃水浴中10分鐘，使膠徹底融化（加熱融膠時，每2分鐘混勻一次）。、步驟和操作要領(lǐng)。為了建立種、株特異的PCR診斷技術(shù)，需要確定種、株特異的遺傳標(biāo)記。② 點樣：取PCR擴增產(chǎn)物3～5 μl，與適量的加樣緩沖液（Loading buffer, LB））混勻(若為6XLB，35 μl擴增產(chǎn)物加1 μl 6X LB)，然后用取液器將樣品加入點樣孔中，同時設(shè)以適宜的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物（marker）作為參照。、步驟和操作要領(lǐng)。(3)瓊脂糖電泳的基本原理。為了有效地切割限制性酶切位點，在限制性酶識別序列的5’端常需添加23個非特異的額外堿基。⑤ 兩個引物之間不能互補，尤其應(yīng)避免3’ 末端的互補重疊以防止形成引物二聚體。含有50%G+C的20個堿基的引物其Tm值約界于56～62℃，這可為有效退火提供足夠的溫度。 ml離心管中于20℃冰箱保存?zhèn)溆谩懸液/1 ml清洗樹脂的比例），旋渦震蕩混勻。g/181。對于雞球蟲，%重鉻酸鉀溶液的卵囊懸液以2000g離心10min，棄重鉻酸鉀溶液?；厥蘸蟮南x體基因組DNA液用WizardTM DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。 應(yīng)根據(jù)研究目的來決定是從單個蟲體還是多個蟲體提取基因組DNA。 PCR擴增產(chǎn)物。2．器具。(2) DNA裂解液：500 mM NaCl 70 181。二、實驗儀器和材料（一）寄生蟲基因組DNA的提取及純化。而且PCR技術(shù)的操作過程也相對簡便快捷，無需對病原進(jìn)行分離純化；同時可以克服抗原和抗體持續(xù)存在的干擾，直接檢測到病原體的DNA，既可用于蟲種、株的鑒別，動物寄生蟲病的臨床診斷，又可用于動物寄生蟲病的分子流行病學(xué)調(diào)查。(1) 乙二胺四乙酸（ Ethylene diaminetetra acetic acid，EDTA）、十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸（Tri (Hydroxymethyl) AminomethaneHCl，TrisHCl）、氯化鈉、蛋白酶K（25181。(3) WizardTM DNA CleanUp 試劑盒或類似的DNA提取試劑盒。(1) 10PCR Buffer（無Mg2+）、dNTP（ mM each）、ddH2O 、MgCl2（25 mM）、Primers、Ex Taq酶（5 U/ml）、瓊脂糖、EB（10mg/ml）、Tris堿、硼酸（Boric acid）、去離子水、EDTA（ mol/L，pH ）、10載樣緩沖液。3．試劑。從凍干或50%70%乙醇保存的寄生蟲材料中也可較容易地提取DNA。若蟲體較大，用鑷子將保存在70%的酒精溶液中的蟲體材料取出，剪取其中部，保存其頭端或尾端部分。用滅菌且經(jīng)紫外燈照射過的微型眼科剪刀將蟲體組織剪碎，加入280181。首先進(jìn)行蟲體DNA提取，然后按Promega公司試劑盒WizardTM DNA CleanUp System使用說明對DNA進(jìn)行純化。⑥ 將微型柱從注射器上轉(zhuǎn)移到一新的離心管上，在柱中央加入30～50181。設(shè)計引物時要遵循以下原則：① 長度不能太長，也不能太短，一般在18～25個堿基左右；② G+C含量及Tm值：引物的G+C含量以40%～60%為宜。③ 堿基的組成盡量隨機，盡量不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在；尤其是3’ 末端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C；④ 引物內(nèi)部不應(yīng)有互補序列，否則引物自身會折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物本身復(fù)性。引物的5’末端修飾包括：加酶切位點，標(biāo)記生物素、熒光、同位素、地高辛等。這種擴增是通過模板DNA、引物之間的變性，退火（復(fù)性），延伸三步反應(yīng)為一周期（cycle），循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA片段得以擴增。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。① 制備凝膠：膠濃度視具體情況而定。如果擴增結(jié)果比較滿意，則用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行攝影，保存圖像。而PCR產(chǎn)物直接回收法則是將擴增的P
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