最權威最齊全的pcr匯總及其原理-程序-免費閱讀
【正文】 這種方法可用于省去多次試驗最佳黏合溫度的工作。乳頭瘤病毒的分型。 科學研究：醫(yī)學、農牧、生物相關分子生物學定量研究。ends)中，也利用巢式PCR增加特異性?！ 〉诙剑菏褂脠D中紅色標記的第二套引物對第一輪PCR擴增的產物進行第二輪PCR擴增。PCR技術的基本原理雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴增產生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。為了保證實驗結果的可靠與準確，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內參（如G3PD）的特異性引物，同時擴增內參DNA，作為對照。 ?。?）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。反轉錄PCR 三、操作步驟 1. 總RNA的提取。反轉錄PCR 二、合成cDNA引物的選擇 1． 隨機六聚體引物：當特定mRNA由于含有使反轉錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。RTPCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞/組織中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。反轉錄PCR又稱為逆轉錄PCR，是指擴增mRNA的一種實驗技術。 對于具有較高Tm的引物，增加退火和延伸時的溫度對反應有利。適用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反轉錄反應。在一步法RTPCR中，在同時為反轉錄和PCR優(yōu)化的條件下，反轉錄和PCR在一直觀眾順次進行。RTPCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。 反轉錄酶的選擇兩種方法Money 鼠白血病病毒反轉錄酶 有較強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。主要用于單一模板的RTPCR反應。較高的溫度有利于減少非特異的引物結合，因而提高特異產物的得率。先將mRNA反轉錄成cDNA，然后再以cDNA為模板，用PCR方法加以擴增。 反轉錄PCR 一、反轉錄酶的選擇 1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。 2. cDNA第一鏈的合成（Reverse Transcription）：目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。 ?。?）于70℃加熱15min以終止反應。 ?。?） 電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。 4． PCR不能進入平臺期，出現(xiàn)平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數(shù)量有關。因此，巢式PCR的擴增非常特異。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。第一輪擴增中，外引物用以產生擴增產物，此產物在內引物的存在下進行第二輪擴增。由于第二套引物位于第一輪PCR產物內部，而非目的片斷包含兩套引物結合位點的可能性極小，因此第二套引物不可能擴增非目的片斷。熒光定量PCR熒光定量PCR 概述 熒光定量PCR是( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗技術，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線
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