用基因芯片檢測單核苷酸多態(tài)性反應(yīng)原理-免費閱讀
【正文】 這些芯片的設(shè)計思路是，先根據(jù)SNP位點的分布特點和頻率選擇一定數(shù)量的位點，通過計算這些位點的個體識別率區(qū)分出世界上的任何一個人,然后根據(jù)這些位點各自獨特的核苷酸序列，設(shè)計寡核苷酸探針，通過一定的流程制成SNP芯片。SNP芯片的出現(xiàn)在某種程度上說，恰恰是為基因診斷的廣泛應(yīng)用提供了很好的工具和平臺，在芯片上根據(jù)相關(guān)致病基因特定的基因組序列，針對各種突變設(shè)計相應(yīng)的核苷酸探針進行檢測。DNA結(jié)合反應(yīng)原理的SNP芯片該方法的原理是在開放模式的DNA芯片上進行非特異性核酸雜交,再用熒光標記的錯配結(jié)合蛋白（Muts）與錯配堿基結(jié)合，根據(jù)熒光的強弱來判定堿基的錯配與否，以此判定SNP位點［16］。該方法與雜交延伸相似，不同之處在于，它利用T4噬菌體DNA連接酶連接DNA切口，以及粘性末端在探針末端連接上特殊設(shè)計的且與樣品DNA中SNP位點下游片段完全互補的熒光標記探針［13］。該方法克服了假陽性高的缺點,適合于精確有效的大規(guī)模基因分型。這種方法的優(yōu)點是簡單、便宜，而且精確度較SBE高，用此方法對芯片上的100個SNP位點、5 000多個基因型進行了試驗，結(jié)果證明正確率是99%［5］。該反應(yīng)很早已經(jīng)被廣泛使用，其優(yōu)點是原理簡單、操作方便，缺點是由于非特異性雜交導(dǎo)致分辨率不高，易產(chǎn)生假陽性［1］。作為第三代遺傳標記的SNP在人類基因組中約每1 000個堿基就出現(xiàn)一個，并具有如下特點：(1)數(shù)量多,分布廣泛；(2)遺傳穩(wěn)定；(3)易于基因分型；(4)適于快速、高通量檢出。用基因芯片檢測單核苷酸多態(tài)性反應(yīng)原理*中國生物工程雜志China Biotechnology, 2005, 25(11):52～56張小燕1**左明雪1張占軍2王忠3李瑤4(1 北京師范大學(xué)生命科學(xué)院北京1008752 北京中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院北京100086)(3 中國中醫(yī)研究院西苑醫(yī)院北京1000914 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院上海200032）摘要基因芯片技術(shù)因其高通量、高效率的特點被用于第三代遺傳標記單核苷酸多態(tài)性位點的篩選。SNP自身的特性決定了它比其他兩類遺傳標記更適合于對復(fù)雜性狀的遺傳解析以及基于群體基因識別等方面的研究,促使人們不斷地尋找新的SNP標記和革新SNP檢測技術(shù)。2005, 25(11)張小燕 等：用基因芯片檢測單核苷酸多態(tài)性反應(yīng)原理中國生物工程雜志 China Biotechnology 2005單堿基延伸反應(yīng)(single base extension，SBE)，又名微測序法(minisequencing),其原理如圖1所示，根據(jù)待檢測樣品的SNP位點5′端序列設(shè)計引物（不包括SNP位點）并將其直接固定在芯片上，以待測樣品的PCR產(chǎn)物作為模板，加以用各色熒光或者其他標記物標記的4種ddNTP，在適當(dāng)?shù)臈l件下，在DNA多聚酶的催化下與PCR產(chǎn)物配對的引物直接在芯片上進行固相單堿基延伸反應(yīng)，根據(jù)樣本序列中特異的堿基（SNP）加入特異的ddNTP，檢測熒光的種類便知SNP信息［2］。圖2SBETAGS檢測SNP基因型Fig. 2SNP genotyping by SBETAGS(a): SBETAGS dual primers。反轉(zhuǎn)錄酶在DNARNA雙螺旋中區(qū)別終端錯配的能力也被用于提高芯片上單核苷酸多態(tài)性分型的精確性。在該方法中，等位基因的可變堿基設(shè)計在探針3′末端，與靶序列的可變形式對應(yīng)。目前所用的大多數(shù)基于芯片的SNP檢測方法只能適用于已知突變的檢測， 但是Muts法對這些技術(shù)進行了補充，由于該方法基于錯配原理而且對于突變位點在探針中的位置和探針長度的要求不像其他芯片那樣苛刻，因而適合于新的SNP位點的發(fā)現(xiàn)。隨著人類基因組計劃和后基因組計劃的開展越來越多的與遺傳病相關(guān)的基因被揭示出來，基因突變檢測技術(shù)已得到了快速發(fā)展，成為診斷多種遺傳病的常規(guī)手段［18］。當(dāng)一個人的基因組DNA經(jīng)過抽提、PCR標記和雜交以后會得出各個位點的結(jié)果，這些數(shù)據(jù)就代表了一個人的身份。SNP芯片目前已被用于這些多態(tài)性的鑒別，以期制作個人鑒別的“基因身份證”。遺傳性疾病的基因診斷是采用分子生物學(xué)的方法在DNA和RNA水平上對某一疾病的相關(guān)基因進行分析，從而對特定的疾病進行診斷。該法原理和操作簡單，酶切特異性強，但是由于酶切可能不完全，所以假陽性率較高。這種在芯片平臺上進行的多重PCR固相擴增反應(yīng)為SNP檢測提供了一個有力的工具，避免了芯片外繁瑣的液相PCR制備靶標的步驟，大大提高了芯片檢測的效率，該方法在診斷和大規(guī)模的基因分型中具有很好的應(yīng)用前景［12］。在該酶介導(dǎo)的等位基因特異性延伸反應(yīng)中利用了錯配引物和完全匹配引物延伸反應(yīng)中的動力學(xué)差異，完全匹配引物的反應(yīng)速度較快，能夠在酶切之前完成引物鏈的延伸，而錯配引物速度很慢，引物延伸速度小于降解速度，最后被完全消化。由于對應(yīng)于每一個位點都有一個不同的標簽，基因型的檢測反應(yīng)能夠以一個多重形式進行，通過引物上
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