動(dòng)物固體組織蛋白提取protocol-免費(fèi)閱讀
【正文】 使用：貯存液100mM， 工作濃度1mM，20度保存。 AEBSF 絲氨酸抑制劑，使用濃度為4 mmol/L。5)避免反復(fù)凍融:6)在pH。4)1作濃度:(1umol/L)5)在水中不溶解。EDTA1)抑制金屬蛋白水解酶。由于蛋白酶抑制劑在液體中的溶解度極低，尤其應(yīng)注意在緩沖液中加人蛋白酶抑制劑時(shí)應(yīng)充分混勻以減少蛋白酶抑制劑的沉淀。在不檢測(cè)和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。RIPA使用方法對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：1. 融解RIPA裂解液，混勻。BCA法：BCA法特點(diǎn)： 1. 靈敏度高，檢測(cè)濃度下限達(dá)到25μg/ml，待測(cè)樣品體積為120μl 。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好?，F(xiàn)對(duì)這兩種方法進(jìn)行比較：一、實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)胞總蛋白提取試劑盒（AR0103）M231BCA蛋白定量試劑盒（AR0146）Commassie改良增強(qiáng)型蛋白質(zhì)定量試劑盒（AR0145）二、操作步驟：Commassie法：（10mg/支）用生理鹽水或PBS稀釋成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml, ug/ml, ug/ml, ug/ml八個(gè)濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。 最終蛋白濃度為：10*Y（ug/ul、mg/ml）g、蛋白樣本放80℃凍存。LOSTWTc、復(fù)孔，再加入54ulH2O，混勻。12000r/min 4176。抽蛋白（應(yīng)冰上進(jìn)行）：a、適量組織（最好放入液氮中反復(fù)研磨成粉狀）加入裂解液中。 裂解液配制：RIPA：PMSF=100：1，現(xiàn)配現(xiàn)用。 超聲粉碎：用超聲粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細(xì)胞破碎，也可用國(guó)產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用40安培，5秒/次，間隙10秒反復(fù)3～5次。a、配工作液：溶液A：溶液B=50：1（200ul：4ul）。e、酶標(biāo)儀檢測(cè)562nm吸光度。當(dāng)你選擇一種蛋白測(cè)定方法時(shí)需要考慮兩個(gè)因素：緩沖液的化學(xué)組成和檢測(cè)的蛋白量。BCA法：，充分混勻。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。（）。DTT小于1mM巰基乙醇低于1mMBCA法和Commassie法各有優(yōu)勢(shì)，在不知道蛋白樣本緩沖液成分的情況下可以兩種方法配合使用，以消除定量的誤差。通常裂解液接觸細(xì)胞12秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解。2. 融解RIPA裂解液，混勻。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。蛋白酶抑制劑破碎細(xì)胞提取蛋白質(zhì)的同時(shí)可釋放出蛋白酶，這些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白質(zhì)不被降解。 28℃可以存放數(shù)月之久。胃蛋白酶抑制劑(pepstantin)l)抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管緊張肽原酶
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